Využití nanočásticových systémů v medicíně

Chemoterapie nádorových onemocnění je často komplikována toxickými vedlejšími účinky cytostatik na zdravé tkáně. Nově navrhované „chytré“ lékové transportní systémy by měly ochránit zdravé buňky před působením léčiva a po dosažení svého cíle – nemocného orgánu nebo tkáně – obsažené léčivo uvolnit jako odpověď na specifický podnět. Spouštěcí mechanismus může být uvnitř buňky (např. místní změna pH) nebo může být externí (např. vnější aplikace zvýšené teploty, magnetického či elektromagnetického pole nebo ultrazvuku). Ideu „magických kuliček“, které procházejí zdravými tkáněmi a zasahují nemocná místa (např. nádory), poprvé vyslovil zakladatel chemoterapie Paul Ehrlich na počátku 20. století. Avšak i po uplynutí sta let zůstává jejich praktické využití na počátku své cesty.

Úvod

Účinek a terapeutická použitelnost mnoha cytostatik používaných ve farmakoterapii rakoviny jsou omezeny jejich nežádoucími účinky na zdravou tkáň a orgány, tj. limitovanou dávkou léčivé látky, kterou je možné pacientovi podat. Vhodným řešením jsou lékové transportní systémy, které by doručily léčivou látku pouze do nemocného místa, maximalizovaly by účinek léčivé látky v tomto místě a snížily by na minimum množství léčivé látky zasahující zdravé části organismu. Místně specifické lékové transportní systémy, tj. systémy pro doručení léčivé látky do požadovaného místa působení, mají mnoho výhod ve srovnání s volným léčivem, ale také se systémy zabezpečujícími pouze jeho postupné nebo prodloužené uvolňování. Koncept cíleného transportu léčiv pomocí „magických kuliček“ vyslovil Paul Ehrlich již v roce 1906. Trvalo tedy téměř sto let, než se mohla tato myšlenka ověřit pro klinické aplikace v humánní medicíně. Jedním ze zásadních charakteristických rysů transportních systémů je malá velikost jejich částic (nanočástice 1–1000 nm), která jim umožňuje dostat se do orgánů, tkání a buněk, jež jsou jiným lékovým formám nedostupné [1]. Nanočásticové systémy je možné v medicíně využít v mnohých aplikacích, např. v klinické diagnostice, pro kontrastní látky v zobrazovacích metodách, v toxikologii, při výzkumu kmenových buněk, v bioanalytickém výzkumu a bioseparacích nebo v buněčných biosenzorech a biočipech [2]. Největší zájem se však věnuje systémům pro cílené uvolňování léčiv. Existují přibližně tři základní strategie cíleného transportu léčiv (obr. 1) [3]: (a) přímé doručení léčiva do určeného místa (např. přímou injekcí) a lokální uvolnění léčivé látky; (b) pasivní cílený transport (targeting), při kterém se lékový transportní systém dostane do určeného orgánu nebo místa působení díky své vnitřní vlastnosti, např. velikosti částic nebo lipofilitě; (c) aktivní cílený transport, kdy je lékový transportní systém vybaven směrovací částí, která jej doručí do požadovaného místa působení. Na aktivním transportu léčiv se může podílet léková forma, směrovací část nebo obě strategie dohromady. Popisují se tři typy směrovacích částí: monoklonální protilátky, externí spouštěcí jednotky a interní spouštěcí jednotky. Monoklonální protilátky jsou zaměřeny proti určitým buněčným typům nebo tkáním, zvláště nádorům; je možné použít i další molekuly vykazující vazebnou specifitu k některým buněčným receptorům, např. lektiny nebo aptamery. Druhou možností je zvnějšku řízený transport částic, např. magnetickým polem. Třetí možností je navržení částic tak, aby se rozpustily nebo rozložily specifickým enzymem nebo při změně pH, a tak doručily svůj obsah do určitého místa v těle, např. do tenkého nebo tlustého střeva nebo dovnitř nádoru s nižším pH, než je pH krve.

Nano- a mikročásticové systémy

Různé systémy zahrnující nano- a mikrosféry, nano- a mikrotobolky, polymerové micely, lipozomy a dendrimery byly uvedeny a popsány v článku [1], na který toto sdělení navazuje, jejich základní vlastnosti uvádí tab. 1.

Největším obecným problémem cíleného transportu částicových systémů krví je vlastní obranný systém organismu, např. filtrace částic plícemi a pohlcení částic makrofágy retikuloendotelového systému (RES). Dalším důležitým rysem při návrhu nano- a mikročásticových systémů je zabezpečení dvou protichůdných požadavků, tj. připojení léčivé látky k částici a její opětovné uvolnění v požadovaném místě. Léčivá látka se tak stává nejprve farmakologicky neúčinnou; účinek se projeví až po jejím odpojení z nosiče. Důležitá je také rychlost uvolňování léčiva, která by měla zabezpečit jeho optimální účinek. U makromolekulárních léčiv, např. oligonukleotidů, nukleových kyselin nebo protilátek, se požaduje jejich transport dovnitř buňky, nebo dokonce do buněčného jádra; pokud se léčivo uvolní jinde, pak nemá požadovaný účinek.

Opsonizace

Osud léčiva in vivo závisí na četných faktorech včetně cesty podání, distribuce v organismu, metabolismu a vylučování. Distribuce léčiva v organismu závisí v podstatě na jeho fyzikálně-chemických vlastnostech. Pokud je léčivá látka špatně rozpustná, náchylná k enzymatickému rozkladu nebo toxická pro irelevantní tkáně, je třeba ji chemicky modifikovat nebo doručit do místa jejího působení pomocí speciálního nosiče nebo transportního systému. Z nových pomocných látek je zájem především o biodegradovatelné nosiče. V současné době existuje celá řada biodegradovatelných koloidních částic s léčivou látkou v různých stadiích výzkumu, vývoje a klinických studií [4]. Pro použití v humánní medicíně musí být všechny složky nosiče nebo systému biokompatibilní a biodegradovatelné tak, aby se vyloučily po doručení léčivé látky bez vyvolání nežádoucích účinků, jako jsou toxicita, zánět, alergie nebo hematologické problémy [5]. Pro intravenózní aplikaci by částice měly mít rozměry v nanometrech tak, aby mohly cirkulovat v krevním oběhu bez zachycení v plicních kapilárách. To také znamená, že by částice neměly tvořit shluky během uchovávání, sušení, resuspendování ve vodě nebo po injekčním podání a při kontaktu s bílkovinami krevní plazmy. Přes svou nespornou užitečnost ve funkci nosičů léčiv jsou nanočástice pro živý organismus cizími tělísky a jako takové vyvolávají jeho obranné reakce. Všechny typy nanočástic jsou v krevním oběhu odstraněny většinou makrofágy v orgánech RES a cirkulujícími leukocyty. Této skutečnosti lze využít pro doručení léčiv do orgánů RES, např. jater a sleziny, pasivním targetingem [3]. Pro léčiva určená k transportu do nemocných buněk mimo orgány RES je však zapotřebí obranné mechanismy organismu překonat nebo se jim vyhnout tak, jako to umějí některé patogeny [6]. Některé polysacharidy přítomné na vnější straně patogenu jsou schopné spolupracovat s lidskými regulačními proteiny, a tak bránit spuštění aktivačních obranných mechanismů. Důležitá je struktura polysacharidu; i velmi malý rozdíl ve struktuře může vést k výrazným rozdílům v rozlišení hostitelským obranným systémem [7]. Biomimetické strategie se snaží modifikovat povrch nanočástic tak, aby zastavily nespecifický útok obranného mechanismu proti nim. Zkoušelo se připojení heparinových struktur [8], karboxymethylových skupin, dextranu [9], chitosanu [10]. Známé je kovalentní navázání hydrofilních polymerů, zejména makrogolů (PEG – polyethylen-glykol) na povrch částic na začátku 90. let. Od té doby se intenzivně sledovaly fyzikálně-chemické i biologické interakce nanočástic s povrchově navázaným PEG. První klinické aplikace dlouhocirkulujících lipozomových nosičů léčiv byly zveřejněny v polovině 90. let a dlouhocirkulující nanotobolky se dostanou do fáze klinického hodnocení v nejbližší době.

Nanočástice s dostatečně dlouhou cirkulační dobou v krevním oběhu jsou předmětem zájmu jak pro diagnostické, tak pro terapeutické účely. Z terapeutického hlediska je to především léčba intravaskulárních onemocnění [11–13], terapeutický transport kyslíku [14] a léčba solidních nádorů.

Dlouhocirkulující lipozomy se dočkaly klinického použití u solidních nádorů, u kterých je porušena celistvost endotelu cév. Endotel, obvykle velmi těsný u zdravých buněk, se stává propustnější u některých infekcí, zánětů a u cév vyživujících solidní nádory. Mezery několik stovek nanometrů se mohou objevit u endotelu cév ohraničujících rostoucí a expandující nádory. To usnadňuje průnik koloidních lékových nosičů a jejich setrvání (retenci) v nádoru. Z lékových transportních systémů jsou ve vodě rozpustné polymery nesoucí neokarcinostatin v klinickém hodnocení [15] a lipozomy s doxorubicinem již jsou užívány v klinické praxi [16].

Vnější spouštěcí mechanismy

Transport léčiv v polymerových micelách do nádorů pomocí ultrazvuku

Intenzivní výzkum polymerových micel jako nosičů léčiv vychází z poznatku, že micely naplněné léčivem se postupně kumulují v intersticiu nádorů nespecifickými interakcemi (pasivním targetingem) [17, 18]. Cytostatické působení polymerových micel tvořených poloxamery (Pluronic: neiontové polyoxyethylen-polyoxypropylenové kopolymery používané jako farmaceutické pomocné látky zejména ve funkci emulgátorů a solubilizátorů [19]) s léčivem spolu s působením ultrazvuku je založeno na kombinaci několika synergických účinků jednotlivých komponent na rakovinné buňky obecně, ale i na buňky rezistentní na běžná cytostatika [20]. Cytostatické působení se připisuje již polymeru samotnému, a to jak na buňky na léčivo citlivé, tak i na buňky rezistentní [21]. Působení poloxameru na zdravé buňky je výrazně nižší. Váže se pouze na povrch buněk a neovlivňuje propustnost membrány [22]. Hlavní výhody ultrazvuku při doručení léčiva do nádoru spočívají v jeho neinvazivním charakteru, v možnosti pronikání hluboko do vnitřních měkkých tkání organismu, jeho frekvenci je možné řídit a jeho působení usměrnit na určité místo. Ultrazvuk zaměřený na nádor:

1. rozruší strukturu micel s léčivem a je spouštěcím mechanismem pro jeho uvolnění;

2. zvyšuje intracelulární příjem jak volného léčiva, tak i léčiva enkapsulovaného v micelách;

3. působí pouze ve vybrané části organismu [23].

Polymerové micely se tvoří z amfifilních blokových kopolymerů v koncentracích vyšších, než je kritická micelární koncentrace, jsou relativně kompaktní, s hydrofobním jádrem a hydrofilní stěnou [24], malou velikostí (10–30 nm), povrchovými vlastnostmi umožňujícími enkapsulovat až 20 % léčivé látky a dlouhým cirkulačním časem (hodiny až dny) v krevním oběhu [25]. Polymerové micely, stejně jako ostatní transportní lékové nanosystémy, chrání léčivou látku před interakcemi se zdravými tkáněmi a redukují její nežádoucí vedlejší účinky, ale současně jsou dostatečně křehké, aby se rozpadly působením ultrazvuku a uvolnily obsažené léčivo v určeném čase v cílovém místě. Kromě vlastností uvedených v tab. 1 je výhodou uvolnění léčivé látky místně i časově řízeným způsobem pomocí ultrazvuku a vyšší intracelulární příjem léčiva enkapsulovaného v micelách [23, 26]. Působení polymerových micel s léčivem na rakovinné buňky schematicky znázorňuje obr. 2.

Výsledky experimentů naznačují vysoký potenciál polymerových micel v kombinaci s působením ultrazvuku pro transport léčivých látek do nádorů a senzibilizaci nádorů rezistentních na léčiva. Důležitým faktorem je frekvence ultrazvuku (nízká frekvence pro větší a hlouběji uložené nádory). Techniku lze aplikovat u řady solidních nádorů s výjimkou nádorů kostí a plic, které ultrazvuk blokují. Vhodnými kandidáty pro tento druh terapie se zdají být nádory prsu, kolonu, vaječníků a dělohy.

Termosenzitivní lipozomy pro hypertermní terapii

Podobně jako ultrazvuk v případě polymerových micel s léčivem slouží k jeho uvolnění, je možné použít jako vnější spouštěcí mechanismus i teplotu. Zájem se soustřeďuje na vývoj termosenzitivních lipozomů a termosenzitivních nanostrukturovaných mikrotobolek.

Kumulace lipozomů v nádorech pasivním targetingem je založena na defektní struktuře cév, které rostoucí nádor zásobují, a jsou tak prostupné pro makromolekuly z krevního oběhu [27]. Touto cestou se mohou v intersticiu nádorové tkáně hromadit i lipozomy [28]. Také hypertermie, tj. speciální zahřátí nádorové tkáně na teplotu o 2–8 °C vyšší, než je tělesná teplota 37 °C, zvyšuje přednostní kumulaci léčiva v nádorové tkáni a propustnost stěny cév [29]. Použití hypertermie k zahájení uvolňování léčiva z lipozomů je neinvazivní, spočívá ve vystavení lipozomů po dosažení místa působení zdroji tepelné energie (mikrovlnná energie, ultrazvuk), výsledkem je vzrůst lokální teploty v nádorové tkáni a rychlé uvolnění léčiva. A tak vývojem lipozomů, které uvolňují svůj obsah při mírně zvýšené teplotě v klinicky rozumném rozpětí 39–42 °C, se urychlí a zvýší jak kumulace lipozomů v nádoru, tak i účinek léčiva po jeho uvolnění [30]. Vzrůst permeability fosfolipidové dvojvrstvy při jejím zahřátí a přechodu z gelu na sol byl pozorován již na počátku 70. let minulého století. Pod teplotou fázového přechodu T_m jsou fosfolipidové molekuly těsně uspořádány a příčná difuzivita je velmi malá. Po zahřátí nad T_m jsou molekuly pohyblivější a propustnější [31]. Protože T_m určuje načasování a rychlost uvolnění léčivé látky, je prvním stupněm v návrhu termosenzitivních lipozomů výběr vhodného složení fosfolipidů. Jako hlavní složka se nejčastěji používá dipalmitoylfosfatidylcholin s 10 % ve vodě rozpustného lysolipidu (např. monopalmitoylfosfatidylcholinu) a 4 % distearoylfosfatidylethanolaminu s PEG pro zvýšení stability lipozomů v krevním oběhu. Lipozomy uvedeného složení s obsahem doxorubicinu uvolňují léčivo při vhodné klinicky použitelné teplotě 39–42 °C velmi rychle (v desítkách vteřin), a zabezpečují tak ideální transportní systém pro léčiva jeho typu [3]. Doxorubicin patří mezi toxická léčiva, pro jeho optimální účinek v nádorové tkáni se požaduje působení vysokých koncentrací léčiva po krátkou dobu [32]. Tyto lipozomy (ThermoDoxTM) v kombinaci s mírnou hypertermií jsou v 1. fázi klinických studií v terapii rakoviny prostaty, prsu a metastáz v játrech [3].

Uvedený příklad naznačuje, že by se lipozomy neměly navrhovat pouze pro uvolnění léčiva v požadovaném místě, ale také v souladu rychlosti uvolňování s mechanismem jeho působení. Lysolipidové termosenzitivní lipozomy mohou sloužit také k transportu dvou různých léčiv určených pro kombinovanou terapii současně. Příkladem může být doxorubicin a cyklofosfamid v terapii rakoviny prsu za předpokladu, že je terapie kompatibilní s hypertermií. Koncentrace obou léčiv se dá upravit výběrem vhodného poměru dvou různých typů lipozomů s obsahem odpovídajících léčiv. Dalším příkladem je kombinace cisplatiny a etoposidu v terapii rakoviny plic [33].

Na poněkud odlišném principu jsou založeny termosenzitivní nanostrukturované mikrotobolky. Ty kromě svých základních konstitutivních materiálů (polylaktid, ethylcelulosa) využívají polymery, které v závislosti na teplotě bobtnají nebo se smršťují. Rychlost bobtnání nebo smršťování hydrogelu polymeru závisí na jeho rozměru, protože čas bobtnání/smršťování je úměrný čtverci lineárního rozměru gelu [34], tj. čím menší částice, tím rychlejší bobtnání nebo smršťování. Tento poznatek vedl k začlenění termoresponzivních komponent do nano- a mikročásticových systémů s rychlejší odpovědí na teplotní změny [35]. Struktura takových systémů určuje rychlost a způsob uvolňování léčiva; základní typy nanostrukturovaných mikročástic jsou schematicky znázorněny na obr. 3. Nejužívanějším termoresponzivním materiálem pro tyto účely je polyN-izopropylakrylamid s teplotou přechodu 32 °C [36]. Mikrotobolky s tímto polymerem v pórech své stěny uvolňovaly svůj obsah při teplotách 37–42 °C. Nanostrukturované mikrotobolky mohou být užitečné pro uvolnění léčiva při tělesné teplotě zvýšené nad 37 °C, např. při infekčních onemocněních organismu a při aplikaci vnějšího teplotního zdroje pro pulzní uvolňování vhodných léčivých látek.

Vnitřní spouštěcí mechanismy

pH senzitivní lipozomy

Lipozomy našly uplatnění jako nosiče v kosmetických přípravcích, adjuvantní látky vakcín, lékové transportní systémy (pro nádorová onemocnění, oční, plicní a infekční nemoci), nosné systémy nukleových kyselin (pro genovou terapii) a diagnostiku (radionuklidy a magnetické kontrastní látky). Největšímu zájmu se těší jejich intravenózní aplikace, pro kterou byly vyvinuty speciální lipozomy se zvýšenou biologickou stabilitou a dobou cirkulace (např. s fosfatidylethanolaminem – PEG) [37], s aktivním targetingem do specifických buněk a tkání (připojením ligandů z monoklonálních protilátek, transferinu, glykolipidů nebo kyseliny listové) [38] a s doručením enkapsulovaného léčiva dovnitř buňky (včleněním lipidů podléhajících přeměně po interakci s biologickými membránami nebo během endocytózy) [39].

pH senzitivní lipozomy jsou stálé při fyziologickém pH (pH 7,5), jejich stabilita se však mění při jeho nižší hodnotě (v kyselé oblasti) za současného uvolnění obsaženého léčiva. Koncepce pH senzitivních lipozomů je založena na poznatku, že některé viry ztrácejí svou stěnu v kyselém prostředí endozomu, a tak infikují buňky, a také na skutečnosti, že některé patologické tkáně (nádory, záněty, infekce) vykazují nižší hodnoty pH než normální zdravé tkáně. Nejčastější složení pH senzitivních lipozomů představuje kombinace fosfatidylethanolaminového derivátu (např. dioleoylfosfatidylethanolamin) s jinými lipidy nesoucími aniontové skupiny (např. karboxylové), které stabilizují lipozomy při neutrálním pH. Aniontové skupiny lipidů jsou v kyselém prostředí protonovány, tím se naruší stabilita lipozomů a uvolní se jejich obsah [40] (obr. 4). Amfifilní stabilizátory a jejich koncentrace se vybírají podle požadovaných vlastností lipozomů, jako je průnik do buňky, stálost v krevním oběhu, citlivost na pH. Tyto lipozomy pronikají do buněk snáze než konvenční lipozomy [41], připisuje se to jejich agregaci a snadnějšímu přilnutí k buněčné membráně. Další zlepšení představuje targeting zprostředkovaný receptory připojením specifických ligandů (např. protilátek) ke stěně lipozomů [42]. To demonstruje, že (a) rozsah vstupu lipozomů do buněk je pro doručení léčivé látky a její účinek v buňce zásadní a (b) endocytóza zprostředkovaná receptory je účinnější než nespecifická endocytóza. Nezbytně důležité pro uvolnění obsahu lipozomu je kyselé prostředí endozomu [43], i když některé nedávné práce připouštějí, že nebude pravděpodobně jediným mechanismem při porušení stability lipozomů uvnitř buňky [44].

Pro stabilitu pH senzitivních lipozomů in vivo v krevním oběhu je vhodné včlenění konjugovaných lipidů nesoucích PEG, sníží se tak jejich vychytávání RES [45]. pH senzitivní lipozomy se studovaly prozatím na buněčných kulturách a zvířecích modelech jako nosiče pro cytostatika [46, 47], oligonukleotidy [48], proteiny a peptidy [49].

Polymerové nanogely pro transport léčiv

Polymerové nanogely odpovídající na různé podněty v závislosti na připojených skupinách, např. na změnu pH, teploty, světla, na cyklodextrin nebo redoxní reakce, jsou dalším typem nanočásticových materiálů vhodných pro cílený transport a účinek léčivé látky. Základem gelových částic bobtnajících při pH v alkalické oblasti je kyselina polymethakrylová; gely, které naopak bobtnají při kyselých hodnotách pH, jsou tvořeny poly-2-vinylpyridinem, poly-2-diethylaminoethylmethakrylátem nebo poly-2-diizopropylaminoethylmethakrylátem. Většina termoresponzivních nanogelů je založena na poly-N-izopropylakrylamidu; byly však připraveny i gelové částice reagující jak na změnu pH, tak na změnu teploty. Nanogely s cyklodextrinem se osvědčují při transportu, ochraně a uvolňování proteinových léčiv. Fotoresponzivní nanogely z poly-N-izopropylakrylamidu, kyseliny polyakrylové a nanovláken zlata jsou schopny poutat a uvolňovat léčivou látku v závislosti na smršťování a bobtnání gelu, které je vyvoláno světlem a změnou teploty. Podobný efekt zapínání (on) a vypínání (off) vykazují také samooscilující nanogely, které fungují na principu redoxních změn při reakci Belousova a Zhabotinského [50].

Směrování nano- a mikročástic

Magnetické nano- a mikročástice

Transport léčiva ve vhodném systému lze ovlivnit magnetickým polem. Magnetický transport je fyzikální metoda doručení magnetických nano- a mikročástic neobsahujících léčivo nebo s jeho obsahem do nemocného orgánu nebo oblasti pomocí vnějšího magnetického pole. Magnetické řízení částic a jejich koncentrace v cílovém orgánu nebo místě je aktivní proces, následující uvolňování léčiva je proces pasivní, určený vnitřními vlastnostmi magnetických částic; je možné použít i spouštěcí mechanismy, např. hypertermii nebo ultrazvuk.

Přednosti této metody transportu částic jsou podobné jako u výše popsaných technik, tj. doručení významně vyšších dávek léčiva do nemocných tkání a snížení zátěže ostatních zdravých částí těla. Magnetické nano- a mikročástice obsahují biodegradovatelnou polymerovou složku (albumin, fosfolipidy, polylaktid, dextran, chitosan, polyalkylkryanoakrylát, polyethylen-imin) a magnetickou složku tvořenou Fe₃Co nebo magnetitem. Nejobvyklejší metodou k vytvoření magnetického pole pro targeting magnetických částic je použití permanentních magnetů nebo elektromagnetů.

Magnetickým doručením léčivé látky se zvýší její koncentrace v nádorech s dobrým krevním zásobováním dosažitelným arteriální cestou. Targeting lze navíc monitorovat různými zobrazovacími technikami, jako jsou magnetická rezonance, počítačová tomografie nebo pozitronová emisní tomografie. Transport cytostatika touto metodou slibuje delší přežití, méně nežádoucích účinků a kratší a méně toxickou léčbu. Léčivo se z částic uvolňuje většinou desorpcí a difuzí; hlavními hnacími silami jsou pH, osmolalita a rozdíly v koncentraci léčiva mezi částicemi, krví a tkáněmi. První klinické pokusy s magnetickými částicemi nesoucími doxorubicin uskutečnila společnost FeRx Inc. u inoperabilních karcinomů jater [51]. Kromě nosičů chemoterapeutik a dalších léčivých látek (protiinfekčních, antitrombotických, protizánětlivých, antirevmatických, léčiv pro fotodynamickou terapii) je možné magnetické částice s léčivem nebo bez léčiva využít při embolizaci a hypertermii.

Aglomerace magnetických nano- a mikročástic závisí na jejich velikosti a tvaru a může vést k embolizaci krevních cév a kapilár. Přestože je tento aglomerační mechanismus v požadované oblasti účinný sám o sobě, používá se často v kombinaci s dalším terapeutickým postupem, např. hypertermií, radioterapií nebo chemoterapií. Magnetická embolizace umožní přerušit přívod krve do nádoru nebo orgánu, následuje hypoxie a nekróza cílové oblasti. Částice často zůstávají v oblasti i po odstranění magnetu.

Relaxaci magnetických částic působením vnějšího střídavého elektromagnetického pole je možné využít jako zdroj vnitřního zahřívání [52]. Hypertermie je definována jako terapie při zvýšených teplotách 42–48 °C. Používá se výhradně k lokální terapii rakoviny a je založena na citlivosti nádorové tkáně ke zvýšeným teplotám. Zatímco tepelné poškození zdravé tkáně je reverzibilní, hypertermií vyvolaná smrt nádorových buněk je nevratná. Hypertermie se normálně kombinuje s dalšími léčebnými postupy, např. s ozařováním nebo chemoterapií. Magnetito-dextranové nanočástice (10 nm) vyvinuté Jordanem a kol. [53] pro kombinovanou magnetickou hypertermii s radiační terapií se dostaly do 2. fáze klinických studií u karcinomu děložního hrdla, rekta, prostaty a dalších. Výsledky vypadají slibně, nevýhodou je však přímé injekční podání částic do nádoru a jejich obtížná rovnoměrná distribuce v něm.

Nejúčelnějším využitím radioizotopů při léčbě rakoviny je doručení jejich dostatečně velké dávky do požadovaného místa bez poškození okolní tkáně. Magnetické částice mohou mít radioizotopy buď ve své matrici nebo připoutané ke svému povrchu. Výhoda této metody ve srovnání se standardními postupy spočívá v tom, že lokální radiační dávka může být velmi vysoká a lze ji aplikovat jedenkrát, na rozdíl od šestitýdenní standardní denní radioterapie. Pro různá onemocnění se používají různé radioizotopy, které se nesmějí z částic uvolnit před dosažením požadovaného místa. Po ozáření by se měly částice rozložit bez vzniku toxických produktů nebo nežádoucích reakcí. Do částic lze současně včlenit i léčivo, které senzibilizuje rakovinné buňky k záření odolné. Tak je možné zvýšit efektivitu léčby a snížit dávku ozáření. V částicích se vyzkoušely izotopy pro terapeutické i diagnostické účely, jako jsou 111In, 125I, 188Re a 90Y [54].

Nejnovější aplikací magnetických nano- a mikročástic je transport genů. Genová terapie rakoviny i dalších onemocnění představuje rychle se rozvíjející významnou oblast. První zmínku o využití magnetických částic (magnetických lipozomů) pro doručení genů popisuje patent z roku 1995 [55].

Magnetické částice lze použít i pro monitorování farmakokinetiky a uvolňování léčiv, např. pohyb pevných částic gastrointestinálním traktem pro diagnostiku a problematiku motility, která doprovází mnohá onemocnění [56].

Magnetický transport částic bez obsahu léčiva nebo s ním představuje slibnou a rychle se rozvíjející oblast farmacie a medicíny. Má však také některá omezení, kterými jsou např. slábnutí magnetického pole s rostoucí vzdáleností od zdroje, tj. problematický transport magnetických částic do hlubších částí organismu; různá rychlost prokrvení v rozdílných částech organismu, tj. problematika jednotné distribuce částic; aglomerace částic, která může být někdy žádoucí (embolizace) a jindy překážkou, zejména pokud není předvídatelná.

Nanočástice podobné virům

Nejnovější oblastí výzkumu nanočásticových systémů s cíleným trasportem léčiva jsou nanočástice podobné virům, tj. takové systémy, které mají vhodné transportní vlastnosti jako viry, ale nemají jejich vlastnosti nežádoucí, např. infekční, parazitující a imunitní. Analýza sekvence lidského genomu spolu se současnou znalostí molekulárních mechanismů a genetických důsledků u mnohých onemocnění otevírají cestu k použití genetického materiálu pro terapeutické účely. V jednoduchém případě může podání genu obnovit funkci genu poškozeného, který vyvolává onemocnění. Alternativně lze genetickou informaci použít u různých přechodných onemocnění, kde působí příznivě. Genová terapie je velmi žádoucí, ale použití DNA ve farmakoterapii má řadu nedostatků včetně rychlé biodegradace, obtížné difuze buněčnou membránou a cytoplazmou [57]. Proto se vyvíjejí syntetické vektory interagující s DNA za vzniku částic podobných virům. Ideální vektor pro doručení genů by měl interagovat s plazmidem následovně [58]:

1. vytvářet částice o velikosti do 100 nm (větší částice nemohou proniknout stěnami cév);

2. chránit DNA před rozkladem nukleázou;

3. zabezpečit efektivní cirkulaci v hostitelském organismu;

4. zprostředkovat vstup do specifických buněk;

5. podpořit vstup do cytosolu;

6. preferovat intracelulární cestu do jádra, kde se musí genetický materiál uvolnit z nosiče (obr. 5).

Komplexací DNA např. s kationtovými amfifilními látkami nebo kationtovými polymery vznikají kompaktní částice, které zvyšují stabilitu DNA, její dynamiku a vstup do buněk in vitro (obr. 6). Přímá vazba na negativně nabité syndekany, které jsou vnitřními transmembránovými proteiny buněk, se považuje za počátek vstupu kationtových částic do buněk [59]. Také mnohé patogeny interagují s povrchy buněk prostřednictvím těchto transmembránových proteinů. Kationtový náboj a velký povrch vektorů tvořených komplexy DNA napomáhají pozdější difuzi plazmatickou membránou, která je závislá i na velikosti vstupujících částic.

Kationtové tenzidy, např. cetyltrimethyl-amoniumbromid, na rozdíl od kationtových polymerů, formují DNA do částic obsahujících pouze jeden plazmid [60]. Formování těchto komplexů se řídí elektrostatickými silami mezi kationtovým tenzidem a fosfátovými skupinami DNA. Zvýšení stability se dosáhne připojením thiolových skupin, např. cysteinu. Vzniklé částice jsou homogenní a téměř sférické. Komplexace plazmidů s kationtovými vektory za vzniku kationtových částic chrání DNA před rozkladem nukleázou; stabilitu zvyšuje další modifikace makrogolem (PEG).

Směrování nanočástic s DNA a jejich vstup do specifických buněk umožňují ligandy s vazbou na povrch těchto buněk. Vhodným ligandem může být např. kyselina listová, jejíž receptory se vyskytují u některých rakovinných buněk ve velkém počtu. Nanočástice s DNA, distamycinem a PEG obalené kyselinou listovou byly připraveny v roce 2003 [61]. Částice měly sférický tvar, kompaktní strukturu a jejich průměr se pohyboval okolo 35 nm. Targeting DNA nanočástic modifikovaných PEG-folátem se zkoušel na buněčných kulturách in vitro. Výsledky pozorování konfokální mikroskopií naznačují transport DNA komplexů do perinukleárního kompartmentu velmi se podobajícího lysozomu, kde se rozkládají: pro efektivní genovou transfekci je však nutné prasknutí membrány endozomu.

I přes velký pokrok v oblasti nosičů pro geny je jejich použití in vivo zatím velmi vzdálené. Současný výzkum se věnuje úpravě povrchů nanočástic, jejich obalení směrujícími ligandy a zmenšování jejich velikosti s cílem větší specificity a aktivity. Zbývá také vyřešit výstup částic z endozomu a vstup do buněčného jádra.

Závěr

Biotechnologické postupy umožnily vyvinout nové, velmi specifické, ale také velmi labilní léčivé látky. Doručení těchto léčiv do požadovaného místa jejich působení je pro farmaceutickou technologii velkou výzvou. Nanočásticové systémy se jeví dobrými kandidáty pro cílený transport léčiv, jsou však obecně rozlišitelné jako cizorodé částice obranným systémem těla. Aby se této identifikaci částic předešlo, je třeba nejprve porozumět lépe biologickým mechanismům regulujícím opsonizaci, adhezi a fagocytózu částic. Pro dosažení cílového místa a prostup buněčnými membránami je třeba odhalit, jak se možné „vstupy“ do buněk dají otevřít a pak zase zavřít pro průnik léčiva s nosičem dovnitř buňky bez vyvolání lýzy, tj. stejnou cestou, jako to umějí viry. Všechny tyto požadavky zdůrazňují potřebu výzkumu a vývoje biomimetických strategií. Nezbytné je také zabránit degradaci citlivých léčiv uvnitř buňky a doručit je v aktivní formě až do požadovaných subcelulárních struktur. Zbývá tak udělat ještě mnoho práce, předtím než bude možné plně prakticky využít „magické kuličky“ ke zlepšení účinnosti a bezpečnosti léčivých látek.