Ektonukleotidáza CD73 jako potenciální terapeutický cíl u nádorových a autoimunitních onemocnění

Souhrn:
Generace extracelulárního adenosinu ektonukleotidázou CD73 je protizánětlivá a imunosupresivní dráha, která hraje významnou roli v regulaci funkcí řady buněk imunitního systému. Naše a další laboratoře popsaly význam této dráhy pro kontrolu tvorby nádorů na mnoha preklinických modelech. Tento efekt je důsledkem modulace protinádorových imunitních odpovědí, metastazování nádorových buněk, jejich proliferace a apoptózy, stejně tak jako modulace angiogeneze uvnitř nádorů. Navíc existuje mnoho důkazů, které u některých druhů nádorů, jako je např. triple negativní karcinom prsu, spojují míru exprese CD73 se špatnou prognózou. Tyto studie poskytují významný důvod k vývoji cílené léčby proti této dráze a k jejímu zavedení do klinické praxe. Data týkající se CD73 a extracelulárního adenosinu u autoimunitních onemocnění jsou omezená, nicméně se zdá, že jejich úloha závisí na konkrétním onemocnění. Naše laboratoř demonstrovala na myším modelu revmatoidní artritidy (kolagenem indukované artritidy), že CD73 má u tohoto typu onemocnění protektivní význam, a data získaná od pacientů naznačují, že alespoň u některých z nich by farmakologické ovlivnění této dráhy mohlo být prospěšné.

Key words: CD73, adenosine, cancer immunotherapy, autoimmunity, rheumatoid
arthritis.

Summary:
Ectonucleotidase CD73 mediated generation of extracellular adenosine has been recognized as an anti inflammatory and immunosuppressive pathway, which plays an important role in the regulation of function of multiple immune cell types. Our laboratory and others have implicated this pathway in the control of tumorigenesis in many preclinical tumor models. This effect is a consequence of modulation of anti tumor immune responses, tumor cell meta-stasis, their proliferation and apoptosis, as well as the modulation of intratumoral angiogenesis. There is also much evidence linking the level of CD73 ex-pression and poor prognosis in certain cancers, such as triple negative breast cancer. These studies provide good rationale for developing and introducing targeted therapies against this pathway in the clinic. Data on the role of CD73 generated adenosine in autoimmune diseases are more limited, and its role appears to be disease specific. Using a mouse model of rheumatoid arthritis (collagen induced arthritis), our laboratory demonstrated that CD73 has a protective role in this type of disease, and data obtained from patients suggest that at least some of them may benefit from pharmacologic enhancement of this pathway.

Úvod

Ektonukleotidáza CD73 je klíčový enzym v metabolické dráze, která vede k rozštěpení extracelulárního adenosintrifosfátu (ATP) a k produkci extracelulárního adenosinu, mediátoru hrajícího důležitou signální roli v řadě tkání, od kardiovaskulárního systému přes nervo-vý až po imunitní systém. CD73 je součástí komplexu enzymů, receptorů a přenašečů, které můžeme souhrnně označit jako adenosinergní systém. V poslední době se ukazuje, že terapeutické ovlivnění adenosinergního systému by mohlo být velmi slibným přístupem v léčbě řady onemocnění, jako jsou ischemická choroba srdeční, Parkinsonova choroba, revmatoidní artritida a nádorová onemocnění [1–3]. Naše labora-toř se věnuje výzkumu role CD73 a dalších členů adenosinergního systému u nádorových a autoimunitních onemocnění.

Charakteristika molekuly CD73 a adenosinergního systému

Extracelulární adenosin je primárně produktem enzymatického štěpení ATP, který je uvolněn z buněk v důsledku porušené buněčné integrity nebo v důsledku transportu z nitra buňky, činností ektonukleotidáz CD39 a CD73 (obr. 1) [1,2,4,5]. Ektonukleotidáza CD39 je integrální membránový protein štěpící ATP (a méně účinně ADP) na adenosinmonofosfát (AMP). Na svém povrchu ji nesou buňky imunitního systému i endotelové buňky a její exprese je zvýšena působením prozánětlivých cytokinů, oxidačního stresu a hypoxie.

Ektonukleotidáza CD73 představuje buď protein vázaný na membránu přes glykofosfatidylinositol (GPI), nebo solubilní protein, kte-rý je enzymaticky aktivní ve formě dimeru a jehož enzymatická aktivita spočívá v konverzi AMP na adenosin. Vyskytuje se na povrchu buněk řady tkání, včetně epitelových buněk, buněk imunitního systému a endotelových buněk. Míra exprese CD73 je řízena faktory, jako jsou hypoxie a přítomnost prozánětlivých cytokinů, a je také pozitivně ovlivněna řadou léčivých látek, např. indometacinem, statiny, methotrexatem a sulfasalazinem. Enzymy CD39 a CD73 fungují společně, ale zatímco účinek ektonukleotidázy CD39 je reverzibilní, účinek enzymu CD73 je prakticky ireverzibilní. Extracelulární adenosin se následně může vázat na specifické adenosinové receptory nebo je účinkem adenosindeaminázy (ADA) konvertován na inosin či může být nukleosidovými transportéry přepraven do nitra buněk. Na povrchu buněk se vyskytují čtyři různé adenosinové receptory, které jsou asociovány s G proteinem – A1, A2A, A2B a A3. Receptory A1 a A3 jsou spojeny s podjednotkou Gi/o a přenášejí signál, který vede k inhibici cyklického 3´,5´ adenosinmonofosfátu (cAMP) a k aktivaci proteinkinázy A (PKA) a fosfatidyl­inositol 3 kinázy (PI3K). Receptory A2A a A2B jsou asociovány s podjednotkou Gs a přenášejí signál, který vede k aktivaci cAMP a PKA. Přenos signálu přes všechny čtyři receptory vede k aktivaci mitogenem aktivované kinázy (MAPK) a proteinkinázy C (PKC).

Role CD73 v imunitním systému

Extracelulární adenosin je důležitou součástí mechanismů, které slouží k negativní regulaci imunitních odpovědí [4,6]. Jeho význam v imunitním systému je zřejmý i z klinického obrazu pacientů, kteří trpí těžkou kombinovanou imunodeficiencí v důsledku deficitu ADA. Dostupnost tzv. knockoutovaných myší s deficity jednotlivých molekul adenosinergního systému umožnila studovat význam těchto molekul. Studie u myší s deficitem adenosinového receptoru A2A prokázaly důležitou roli adenosinu a receptoru A2A v potlačení zánětu. Ektonukleotidázy CD39 a CD73 fungují jako „molekulární přepínač“, který mění extracelulární prostředí z prozánětlivého (boha-tého na ATP) na protizánětlivé (bohaté na adenosin). Navíc míra exprese ektonukleotidáz při zánětu stoupá a vede k potlačení aktivace a akumulace neutrofilů a k akumulaci protizánětlivých makrofágů M2.

Adenosinergní systém však hraje také důležitou roli i v regulaci adaptivního imunitního systému. Efektorové T lymfocyty mají na svém povrchu receptory A2A, které přenášejí signál inhibující aktivitu těchto buněk. Adenosin, který se váže na receptory A2A na efektorových T lymfocytech, může být generován regulačními T lymfocyty CD4+ FoxP3+, které mají na svém povrchu CD39 a CD73.

Studie na knockoutovaných myších s deficitem CD73 a CD39 odkryly důležitou úlohu těchto molekul pro supresorovou aktivitu re-gulačních T lymfocytů a také ukázaly, že adenosin signalizací přes receptory A2A na regulačních T lymfocytech tuto jejich aktivitu zpětně posiluje. CD73 hraje také roli v imunoregulační aktivitě T lymfocytů Th17. Dendritické buňky nemají na svém povrchu CD73, ale vysoké hladiny adenosinu stimulují receptory A2B na jejich povrchu, což vede k jejich diferenciaci v dendritické buňky tolerogenní-ho typu a zároveň favorizuje generaci myeloidních supresorových buněk.

V poslední době se výzkum zaměřil rovněž na roli CD73 a adenosinergního systému u lymfocytů B [7]. Pouze specifické populace myších B lymfocytů, jako jsou paměťové buňky, buňky marginální zóny, B buňky v germinálních centrech a buňky B1, vykazují expresi CD73. Naproti tomu velké procento periferních lidských B lymfocytů vykazuje vysokou míru exprese CD39 a CD73. Ektonukleotidáza CD73 a adenosin hrají roli v izotypovém přepnutí, v homeostáze plazmatických B lymfocytů v kostní dřeni a v supresorové funkci my-ších regulačních lymfocytů B1.

Konečně, CD39 a CD73 hrají důležitou roli v transendotelové migraci leukocytů [6]. Knockoutované myši s deficitem CD39 vyka-zují zvýšenou extravazaci monocytů a neutrofilů způsobenou zvýšenou expresí povrchových markerů CD11b/CD18. Ektonukleotidáza CD73 se nachází na povrchu endotelových buněk krevních cév i aferentních lymfatických cév. Knockoutované myši s deficitem CD73 (CD73 knock out myši) vykazují zvýšenou adhezi leukocytů k endotelu krevních cév, jejich zvýšenou extravazaci, zvýšenou aktivaci endotelu a zvýšené zachycování monocytů. V tomto procesu hraje roli CD73 jak na leukocytech, tak i na endotelu krevních cév. V cévním řečišti hematoencefalické bariéry stimuluje CD73 migraci díky modulaci hladin chemokinu CX3CL1.

Molekula CD73 u nádorových onemocnění

Budoucnost léčby nádorových onemocnění může spočívat v cíleném ovlivnění klíčových imunoregulačních molekul. Podání protilátek zaměřených proti klíčovým (tzv. checkpoint) imunitním inhibitorům CTLA 4 a PD 1, které negativně regulují protinádorovou imunitu, prokázalo klinický účinek a vedlo k nedávnému schválení tří nových léčiv pro pacienty s metastatickým melanomem.

Protože nádory využívají ke svému růstu redundantních imunosupresivních mechanismů, mohla by být léčba zaměřená na inaktivaci i dalších imunosupresivních mechanismů, tedy i na terapeutické ovlivnění imunosuprese způsobené adenosinergním systémem včetně CD73 (obr. 2), pravděpodobně klinicky velmi přínosná [4–6,8].

Role adenosinu jako faktoru podporujícího růst nádoru byla poprvé prokázána za využití A2A receptor knock out myší. Naše labora-toř prokázala, že tzv. CD73 knock out myši jsou rezistentní vůči růstu nádorů [9], a podobná pozorování učinily i jiné laboratoře. Řada nádorů, včetně karcinomu prsu, karcinomu prostaty, leukemie, glioblastomu, melanomu, karcinomu vaječníků a karcinomu tlustého střeva, má na svém povrchu enzymaticky aktivní ektonukleotidázy CD73, CD39 a adenosinové receptory a v tkáních tumoru byla proká-zána vysoká koncentrace adenosinu. Vysoká míra exprese CD73 v nádorech může být způsobena různými mechanismy. Důležitou roli může hrát ischemie uvnitř nádorové tkáně, což vede ke zvýšené aktivitě transkripčního faktoru HIF 1α, který pak přímo reguluje tran-skripci CD73, CD39 a receptoru A2B. Ztráta estrogenového receptoru u karcinomu prsu také vede ke zvýšené míře exprese CD73. Vy-soká koncentrace adenosinu v nádorech také velmi pravděpodobně pochází z infiltrujících CD4+ regulačních a CD4+ Th17 T lymfocytů, jejichž imunosupresivní aktivita alespoň částečně závisí na adenosinu. Naše skupina byla jednou z laboratoří, které na myším modelu demonstrovaly důležitou roli CD73 na CD4+ regulačních T lymfocytech v růstu nádorů in vivo.

Další důležitou otázkou, kterou řešila nejen naše, ale i další skupiny, je prognostická role exprese CD73 u nádorů a význam CD73 ja-ko biomarkeru. Naše skupina prokázala v metaanalýze více než šesti tisíc pacientů s karcinomem prsu, že u triple negativního karcinomu prsu je exprese CD73 spojena s negativní prognózou a s rezistencí na chemoterapii [10]. Tato pozorování naznačují, že u tohoto onemoc-nění by ektonukleotidáza CD73 mohla být vhodným terapeutickým cílem. Podobná korelace byla popsána u karcinomu tlustého střeva. Také u chronické lymfatické leukemie koreluje exprese CD73 s agresivním molekulárním profilem, proliferací nádorových buněk a se senzitivitou na chemoterapeutika [6]. Tato pozorování naznačují, že CD73 a adenosin ovlivňují nádory i nezávisle na jejich působení na imunitní systém.

V dalších studiích jsme prokázali, že CD73 přispívá k nádorové angiogenezi regulací produkce vaskulárního endoteliálního růsto-vého faktoru (vascular endothelial growth factor, VEGF) a že tato role nevyžaduje enzymatickou aktivitu [11]. Následně jsme také prokázali, že CD73 přispívá k tvorbě metastáz, a to nezávisle na imunitním systému [12]. Naše pozorování učiněná na tzv. CD73 knock out myších jsme potvrdili v naší skupině použitím protilátek a enzymatických inhibitorů CD73 a ke stejným závěrům došly i jiné laboratoře. Na myším modelu jsme prokázali účinek kombinace protilátky anti CD73 s protilátkami anti PD 1 nebo CTLA4 [13] a také antimetastatický účinek kombinace protilátky anti CD73 s antagonistou receptoru A2A [14].

Přestože byla publikována řada preklinických studií, které jasně demonstrují přínos inhibice CD73 nebo adenosinových receptorů, nebyly dosud provedeny žádné klinické studie. I když v současné době neexistují humanizované protilátky proti CD73, antagonisté receptoru A2A byli testováni ve fázi III klinické studie u pacientů s Parkinsonovou chorobou. Agonisté receptoru A3 byli také ověřo-váni v klinických studiích u revmatoidní artritidy a psoriázy a jsou zkoušeni v léčbě pacientů s karcinomem jater [6]. Kvůli riziku možných nežádoucích účinků je třeba novou antiadenosinergní léčbu zkoušet uvážlivě, ale je pravděpodobné, že bude klinicky účinná, a to především v kombinaci s jinou imunoterapií nebo chemoterapií.

Molekula CD73 u autoimunitních onemocnění

Molekula CD73 a adenosin hrají významnou roli ve funkci buněk, které jsou důležité pro udržování tolerance. Je proto logické studovat jejich úlohu u autoimunitních onemocnění a určit, zda by i u nich mohla být molekula CD73 biomarkerem a terapeutickým cílem.

Dostupnost tzv. CD73 knock out myší dovolila studovat na tomto modelu průběh různých onemocnění. U starších CD73 knock out myší se spontánně vyskytuje autoimunitní nefritida a glomerulonefritida a tyto myši jsou také náchylné k zánětlivým střevním onemoc-něním [1]. Jsou ale naopak odolnější proti experimentální autoimunitní encefalomyelitidě, a to pravděpodobně díky specifické roli ade-nosinu v hematoencefalické bariéře. Podobně protichůdná pozorování byla učiněna u autoimunitních onemocnění i u molekul, které jsou terapeutickými cíli; například zatímco blokáda tumor nekrotizujícího faktoru (TNF) je velmi účinná u revmatoidní artritidy, blokáda TNF u relabující remitující formy roztroušené sklerózy toto onemocnění zhoršuje. Naše laboratoř se zaměřila na revmatoidní artritidu. Podá-ní antagonistů adenosinových receptorů bylo účinné v preklinických i klinických studiích. Na myším modelu revmatoidní artritidy (ko-lagenem indukované artritidy) jsme prokázali, že CD73 hraje u tohoto onemocnění protektivní roli [15]. Někteří pacienti s revmatoidní artritidou mají vysokou aktivitu enzymu CD73 v synoviální tekutině, která koreluje se známkami zánětu. Zvýšené hladiny CD73 bylo využito terapeuticky u myšího modelu artritidy podáním inaktivního agonisty receptoru A2A, který byl aktivován enzymatickou činností ektonukleotidázy CD73 [16]. Někteří pacienti postižení juvenilní revmatoidní artritidou mají naopak snížené množství CD73 na imunitních buňkách v kloubu a tyto hladiny korelují s aktivitou onemocnění [17]. Pro tyto pacienty by mohlo být prospěšné podání aktivátorů enzymatické aktivity molekuly CD73 nebo látek, které zvyšují její expresi. Konečně, CD73 hraje důležitou roli v protizánětlivém účinku methotrexatu v myším modelu zánětu plic. Bylo by zajímavé zjistit, zda snížená míra exprese CD73 nebo po-lymorfismy genu CD73 hrají roli v účinnosti methotrexatu u revmatoidní artritidy.

Závěr

Řada výzkumných skupin, včetně naší, demonstrovala v preklinických studiích přínos léčebného ovlivnění CD73 a adenosinových receptorů u nádorových a autoimunitních onemocnění. Studie, které popsaly míru exprese těchto molekul a analýzy korelace exprese a klinického průběhu, přinesly pádné důvody k provedení klinických studií. Do budoucna je nutné zaměřit se na pečlivý vývoj vhodných léčiv (protilátek, agonistů a inhibitorů), nalezení vhodných léčebných kombinací a v neposlední řadě i na výběr všech vhodných indikací.