Farmakogenetika aneb správný lék

Polymorfismus je definován jako odchylka v sekvenci DNA, která je přítomna nejméně v 1 % populace, často však bývá rozšířena u mnohem větší části jedincu. V řadě případu polymorfismus vede ke snížené aktivitě například enzymu, receptoru, transportních proteinu, vzácněji naopak muže být aktivita větší. Významem těchto polymorfismu ve farmakologii se zabývá jak farmakogenetika, tak farmakogenomika.

Úvod

„®ivot je chemický systém schopný replikace prostřednictvím autokatalýzy, systém dopouštějící se chyb, které efektivitu autokatalýzy pozvolna zvyšují." Tato definice „života" počítá s chybami v pruběhu evoluce jako s nutnou podmínkou úspěšného vývoje. Nepřekvapí tedy rozmanitost i na úrovni tak uniformního druhu, jakým je člověk. DNA genomu libovolných dvou nepříbuzných osob je sice z 99,9 % shodná, nicméně ono jedno promile neshody znamená, že se v sekvenci milionu páru bazí vzájemně lišíme. Tyto polymorfismy v jednom či v řadě sekvencí nukleotidu vznikly během dlouhého vývoje, kterým jsme prošli za více než pět tisíc generací od společného, pravděpodobně afrického prapředka. Nadchází doba, kdy nemužeme dále ignorovat rozdíly mezi dvěma jedinci též na poli farmakologie. Vzhledem k zaměření tohoto čísla časopisu se zamysleme nad dopadem polymorfismu na některé choroby i na variabilní odpovědi na léky (farmakogenetický pohled) právě v kardiovaskulární oblasti.

Genom, polymorfismus, farmakogenetika a farmakogenomika

Lidský genom představuje ohromné množství více než 3 gigabazí v sekvencích DNA, které tvoří asi 30–35 tisíc genu, pouze u necelé poloviny se však předpokládá, že kódují vlastní proteinový řetězec. Díky řadě kombinací jednotlivých řetězcu proteinu však tento relativně malý počet genu výsledně určuje více než 100 tisíc bílkovinných molekul. Při udržování a předávání informace pomocí sekvence páru bazí DNA mohou vznikat chyby. Naprostá většina je daná odchylkou jednoho páru, tedy bodovou mutací. Podstatné je, jak se tato odchylka v pořadí odrazí na funkci proteinu. Změny, které vedou k záměně aminokyseliny (tzv. missense mutation), mohou vést ke změně struktury, sledované poklesem aktivity např. enzymu, nebo se muže aktivita nezměnit, event. se aktivita muže dokonce zvýšit. Horší alternativou je, když bodová změna kodonu vede k ukončení syntézy řetězce proteinu (tzv. stop kodon). Výpadek, či naopak přidání baze navodí systémovou chybu čtení řetězce (tzv. frame-shift), která zpravidla rovněž ukončí syntézu zbytku molekuly proteinu (obr. 1). Závažné poruchy syntézy duležitých proteinu jsou většinou vývojem eliminovány. Méně závažné odchylky funkce (s nízkou penetrací) však mohou být v populaci časté. V našich více než 30 tisících genech jsou známy asi 2 miliony takovýchto odchylek, polymorfismu. Obecně je polymorfismus definován jako odchylka v sekvenci DNA, která je přítomna nejméně v 1 % populace, často však bývá rozšířena u mnohem větší části jedincu. V řadě případu polymorfismus vede ke snížené aktivitě například enzymu, receptoru, transportních proteinu, vzácněji naopak muže být aktivita větší. Významem těchto polymorfismu ve farmakologii se zabývá jak farmakogenetika, tak farmakogenomika. Farmakogenetika studuje dopad těchto polymorfismu v enzymech aktivujících či degradujících léky, v receptorech určujících odpověi na lék nebo v polymorfismu enzymu určujících syntézu substrátu pro daný lék. Mnohem užší oblast, farmakogenomika, se pak zabývá individuální schopností jedince zacházet s léčivem, tj. variacemi v absorpci, aktivaci, distribuci, vylučování nebo interakci s cílovou strukturou (např. s receptorem).

Význam polymorfismu v léčbě kardiovaskulárních chorob

Polymorfismy u hypertenze

U řady chorob se předpokládá multifaktoriální etiologie. Jedním z příkladu je hypertenze. Zde hraje polymorfismus velmi významnou úlohu na ruzných úrovních. V etiopatogenezi se projeví v aktivitě systému renin-angiotenzin-aldosteron (RAA), v aktivitě b-adrenergních receptoru, aktivitě transportních iontových mechanismu v renálních tubulech či v aktivitě iontových kanálu např. v hladké svalovině cévní stěny nebo myokardu. Vedle etiopatogenetického momentu se polymorfismus též významně uplatní v odpovědi na antihypertenzní léčbu.

Velmi zajímavý je polymorfismus genu cytoskeletálního proteinu zodpovědného za zpětné vstřebávání sodíku v renálním tubulu – a-adducinu, kdy došlo k záměně glycinu za tyrosin (460Gly/Trp). Tato varianta je spojena s vyšší citlivostí k natriu, zvýšenou reabsorpcí sodíku v proximálním tubulu a s hypertenzí, která výborně odpovídá na diuretika [1]. Druhým příkladem hypertenze výrazně citlivé na přívod soli a výborně odpovídající na diuretika je polymorfismus G-proteinu (825C/T). Podobně jako v předchozím případě je zde popsán pokles tlaku po thiazidech více než dvojnásobný proti hypertonikum nesoucím běžnou alelu. Relativně častý je také polymorfismus sodíkového kanálu (T594M), který je opět spojen s hypertenzí a je charakterizován výraznou retencí soli a otoky [3]. Zde je přímým antagonistou tohoto epiteliálního kanálu amilorid. Identifikace těchto v populaci častých genotypu by měla význam nejen v prevenci hypertenze, ale také by pomohla při stanovení optimální léčby.

Když se blíže podíváme na variace v aktivitě systému RAA, vidíme, že na téměř všech stupních se mužeme setkat s polymorfismem. Předpokládá se zejména význam variací daných mutacemi nukleotidu v intronu genu regulujícího aktivitu systému (s následným zvýšením nabídky angiotenzinogenu), v mutacích vedoucích ke změně jeho konfigurace angiotenzinogenu (235Met/ Thr), dále s polymorfismy spojenými se vzestupem nabídky angiotenzinu II nebo s mutacemi vedoucími ke zvýšení afinity receptoru AT1 k angiotenzinu II. Polymorfismy v ose RAA jsou spojeny s rozdíly v účinku inhibitoru ACE i sartanu. Byl dokumentován např. význam ACE I/D genotypu, kdy alela ACE D vedla k výraznější úpravě endoteliální dysfunkce při léčbě inhibitory ACE, nebo větší antihypertenzní účinek inhibitoru ACE u genotypu D/D [4].

Podobně polymorfismus angiotenzinogenu (235Thr) byl spojen s relativní rezistencí k antihypertenzní medikaci nebo polymorfismus na úrovni receptoru AT1 (1166C) vedl k výraznější antihypertenzní odpovědi na losartan [5]. Vedle významu polymorfismu ACE ve farmakoterapeutické odpovědi se uplatní též v incidenci nežádoucích účinku. Tak byl polymorfismus ACE I/I spojen s poklesem renálních funkcí a s vyšším výskytem kašle po podání inhibitoru ACE. Obdobně výskyt kašle byl spojen s polymorfismem bradykininového receptoru B2 [6]. Bohužel ve většině prací byl sledován polymorfismus jen v určitém místě a je více než pravděpodobné, že kombinace polymorfismu na ruzných úrovních povedou bui k potenciaci, či jindy k oslabení výsledného účinku.

S genetickou variabilitou na antihypertenzní odpověi se setkáváme také

u b-blokátoru. Nejčastěji se setkáváme s polymorfismem receptoru b1 a b2. Retrospektivní studie ukazují, že Arg389 forma receptoru b1 je spojena s výraznější b-lytickou odpovědí, prospektivní studie probíhají [7].

Polymorfismy u srdečního selhání

Také odpověi na léčbu chronického srdečního selhání je ovlivňována polymorfismem regulačních systému. Příkladem je příznivější ovlivnění prognózy b-blokátory u nositelu výše uvedeného genotypu ACE D/D (spojenou s vyšší koncentrací angiotenzinu II). Dvouleté přežití u srdečního selhání bylo ve skupině 328 nemocných 78% s alelou ACE I/I a 60% s alelou D/D [8]. Léčba b-blokátory tento rozdíl zcela smazala (obr. 2). Je tedy pravděpodobné, že vyšší aktivace regulačních mechanismu dává předpoklad k lepšímu uplatnění inhibiční terapie.

Polymorfismy v hemostáze

Klinický význam má polymorfismus také v primární a sekundární hemostáze. Rozšířený je polymorfismus glykoproteinového destičkového receptoru GP IIIa. Asi u 15–20 % lidí je přítomna mutace, kdy cytosin je nahrazen thymidinem (PI A1/A2), která je spojená se zvýšenou aktivací a agregací trombocytu. Přítomnost této alely je spojena s rezistencí na kyselinu acetylsalicylovou, s výrazně vyšším rizikem akutních koronárních příhod a s častými trombotickými komplikacemi koronárních intervencí. Například ve studii Waltera a kol. byla frekvence subakutních trombotických komplikací pětkrát vyšší u nositelu PI A1/A2 než u homozygotu PI A1/A1 [9]. Naštěstí citlivost na ticlopidin a clopidogrel je u tohoto typu polymorfismu zachována, a tito nemocní jsou tak optimální cílovou skupinou pro podávání thienopyridinu. Zajímavé jsou také závěry podstudie CARE. Zde byli nositelé PI A1/A2 výrazně ohroženi rekurencí trombotických koronárních komplikací, ale podání pravastatinu bylo schopno tento nepříznivý stav zvrátit [10]. Na úrovni endoteliálního transmembránového receptoru trombomodulinu se též setkáváme s polymorfismem. Vazba trombomodulinu s trombinem inhibuje koagulaci. Záměna alaninu za valin na 455. pozici molekuly trombomodulinu vede ke zvýšené prokoagulační pohotovosti a k šestinásobnému nárustu rizika infarktu myokardu [11]. U nositelu tohoto typu polymorfismu je indikována velmi agresivní protidestičková či antikoagulační léčba. Naopak běžně přítomné dva typy mutací koagulačního faktoru VII jsou spojeny s relativní rezistencí k trombotickým koronárním komplikacím. Také při užití heparinu se setkáváme s významným polymorfismem jednoho nukleotidu v receptoru Fc g trombocytu, který je spojen se zvýšeným rizikem indukované trombocytopenie [12].

Polymorfismy v aterogenezi

Typicky polymorfním proteinem je apolipoprotein E (apo e), který je duležitý pro transport cholesterolu mezi ruznými tkáněmi. U člověka se setkáváme se třemi alelami: apo e2, apo e3 a apo e4. Nositelé apo e4 jsou zhruba dvojnásobně ohroženi koronárními příhodami než při přítomnosti obou druhých alel [13]. Léčba statiny u tohoto polymorfismu však riziko upravuje: u nositelu apo e2, 3 snížil simvastatin mortalitu o 13 % proti 50% poklesu u apo e4 (obr. 3).

Jiným příkladem je polymorfismus genu kódujícího CETP (cholesterylester transfer protein), který se účastní metabolismu antiaterogenního lipoproteinu HDL. Přítomnost alely B1 je spojena s vyšší aktivitou CETP a s nižší koncentrací HDL. V sekundárně preventivní studii REGRESS, v placebové větvi, byla pozorována největší progrese aterosklerózy u nositelu genotypu B1/B1, mírnější progrese u B1/B2 a nejpomalejší u B2/B2. V podskupinové analýze účinku pravastatinu v této studii bylo zjištěno, že maximální vliv hypolipidemické léčby na zpomalení progrese koronárních lézí byl pozorován u nositelu alely B1 (B1/B1 i B1/B2), ale naopak málo ohrožená skupina B2/B2, která tvořila 16 % zkoumané populace, z léčby statinem neprofitovala [14]. V téže studii byl také sledován polymorfismus promotoru genu stromelysinu-1. Tato proteáza se účastní též přestavby ve stěně cévní a muže ovlivnit progresi či destabilizaci aterosklerotické léze. Přítomnost alely 6A vede ke snížení exprese stromelysinu a k akumulaci pojivové tkáně v plátu spojené s progresí [15]. Také při analýze výsledku v placebové větvi studie byl u této skupiny nemocných zjištěn nárust kardiovaskulárních příhod a u nemocných po angioplastice stoupla frekvence restenóz. I zde snížila léčba pravastatinem u nositelu alely 6A riziko výrazněji než u homozygotu 5A/5A. Konečně ve třetí podanalýze studie REGRESS byl sledován dopad polymorfismu b-fibrinogenu. Substituce guaninu za adenin na 455. pozici je spojena se zvýšenou hladinou fibrinogenu. Opět u nosiču genotypu 455A/A byla pozorována výraznější progrese koronárních lézí a nasazení pravastatinu vedlo k úpravě tohoto rizika [16].

Vedle polymorfismu na úrovni metabolismu lipidu a hemokoagulačních faktoru jsou známy též polymorfismy vazoadhezivních molekul, které mají klíčový význam v iniciaci a progresi aterogeneze i v destabilizaci plátu. Tyto molekuly endoteliálního puvodu aktivují (selektiny), přitahují (chemoatraktanty) nebo umožňují navázání leukocytu a jeho přestup do subendoteliálního prostoru (ICAM-1, VCAM-1). Nejvíce je prozkoumán polymorfismus u selektinu P a selektinu E. V populaci jsou přítomny 4 typy polymorfismu v jednom nukleotidu u selekinu P (Ser290Asn, Asn562, Leu599Val a Thr715Pro) a jeden polymorfismus selektinu E (Ser128Arg). Ve studii ECTIM byl sledován význam těchto polymorfismu při vzniku myokardiálního infarktu. Přítomnost alely Thr715Pro vedla k poklesu výskytu koronárních příhod [17].

Velmi zajímavý a intenzivně studovaný je též polymorfismus multifunkčního glykoproteinu trombospondinu (TSP). Tento regulační matrixový glykoprotein zasahuje do mnoha pochodu probíhajících v cévní stěně, zejména kontroluje angiogenezi, proliferaci buněk hladké svaloviny, fibrinolýzu, oxidaci LDL, agregaci trombocytu, tj. děje spojené s aterogenezí a  trombogenezí. Klinický význam polymorfismu TSP sledoval Topol ve velké kohortě 420 rodin s předčasným vznikem koronárních příhod. Mutace v TSP-1 byly spojeny s poklesem trombomodulinu a podle typu polymorfismu s dvoj- až desetinásobným zvýšením rizika koronární příhody proti kontrolním osobám [18].

Polymorfismy a arytmie

V arytmologii se setkáme s polymorfismem na několika úrovních: v etiopatogenezi syndromu dlouhého QT a v metabolismu řady antiarytmik. Syndrom dlouhého QT (LQTS) muže mít genetický podklad v odchylce na úrovni sodíkového kanálu, kdy se vhodně uplatní blokátory sodíkového kanálu ze třídy 1b, nebo je postižen kanál draslíkový [19]. Podle typu poruchy draslíkového kanálu pak mužeme indikovat vhodnou léčbu, u některých typu se zdají být výhodné b-blokátory, a naopak u jiných muže tato skupina vyvolat komorovou arytmii typu torsades de pointes [20].

Význam polymorfismu v metabolismu léčiv

Jedním z hlavních úkolu farmakogenetiky, která má bezprostřední praktický význam, je genotypizace enzymu metabolizujících léčiva. Na rozdíl od polymorfismu diskutovaných v první části nemají odchylky těchto enzymu přímý vliv na výskyt a pruběh choroby.

Organismus má k dispozici v zásadě dvě řady metabolických enzymu: enzymy I. fáze změní molekulu oxidací, redukcí či hydrolýzou, aby molekula byla snáze konjugována s endogenními látkami usnadňujícími rozpustnost potřebnou ke vstřebání, či naopak k vyloučení. Reakce I. fáze jsou zprostředkovány pozoruhodnou rodinou enzymu cytochromového systému

P-450 (CYP). Enzymy II. fáze, kam patří např. glukuronyltransferázy, řada methyltransferáz, tvoří obdobný systém se specifickými substráty.

V zásadě lze rozdělit problematiku na dvě oblasti: farmakogenetiku enzymu modifikujících léčiva (zejména cytochromového systému, glutathion-S-transferáz a N-acetyltransferáz) a na farmakogenetiku transportních mechanismu (např. glykoproteinu P). Polymorfismy těchto enzymu mohou vést k oslabení, nebo naopak ke zvýraznění účinku.

Polymorfismus izoenzymu CYP

Společnou cestou biodegradace nebo bioaktivace podstatné části běžně užívaných léčiv je změna funkčních skupin výchozí molekuly cytochromovým systémem P-450 (CYP). Cílem je zvýšit hydrofilii mateřské molekuly, a tím usnadnit resorpci ve střevě nebo exkreci látky do moče či do žluče. Cytochromový systém P-450 je rodina enzymu, oxygenáz, obsahujících protoporfyrinové jádro (hemoproteiny), které přidáním nebo změnou funkční skupiny mění polaritu endogenních i exogenních molekul. Tak se mění rozpustnost substance, dochází k degradaci či popř. k aktivaci. Vlastní změna funkční skupiny je variabilní a závisí na vlastnostech molekuly substrátu i typu cytochromu. Například jeden z nejduležitějších enzymu, CYP3A4, pusobí N-oxidaci, C-oxidaci, N-dealkylaci, O-dealkylaci, nitro-redukci a C-hydroxylaci. Charakteristické je výrazné překrývání účinku na cílový substrát (jedna molekula muže být modifikována několika enzymy systému) i široké spektrum substrátu pro každý z téměř 500 jednotlivých izoenzymu. Izoenzymy jsou lokalizovány zejména v játrech, ve střevě, v plicích a ledvinách, kde jsou vázány na membrány endoplazmatického retikula.

Podle homologie aminokyselin jsou enzymy CYP přiřazeny do jedné ze 3 skupin: CYP1, CYP2 a CYP3. Jednotlivé izoenzymy jsou dále definovány písmenem a číslicí, podskupiny CYP1A, CYP2C, CYP2D a CYP3A jsou významnější. Pro klinika i farmakologa je duležitých zejména pět skupin izoenzymu: CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 a CYP1A2.

Jak již bylo řečeno, úlohou systému je biodegradace endogenních substancí (např. steroidu, prostanoidu či regulačních proteinu) i exogenních substancí (např. flavonoidu, alkaloidu nebo léčiv). Změna molekuly substrátu muže vést též ke konverzi na aktivní substanci, tj. k aktivaci (příkladem je konverze inaktivních forem vitaminu na aktivní či cholesterolu na steroidní hormony). Oxygenázy CYP též usnadňují resorpci látky ze zažívacího traktu. Systém se rozhodující měrou podílí na first-pass efektu, tj. modifikaci molekuly při prvním pruchodu játry. Vztah enzymu a cílové molekuly je oboustranný. Také cílová molekula muže ovlivnit aktivitu cytochromového systému. Podle vzájemné interakce rozlišujeme tři kategorie. První kategorií je substrát, ten neovlivňuje aktivitu systému CYP. Druhou je induktor, ten naopak zvyšuje aktivitu systému CYP. Konečně třetím případem je, že inhibitor blokuje aktivitu systému CYP. Tato inhibice muže být reverzibilní (kompetice), či ireverzibilní (trvalá blokáda enzymu). Jednotlivé izoenzymy cytochromového systému jsou aktivovány nebo inhibovány odlišnými molekulami. Vzájemné interakce substrátu a induktoru či inhibitoru ve střevě a v játrech nebo v plicích mění presystémovou a systémovou dispozici léku, tj. množství léku, které se dostane do místa svého pusobení.

Na úrovni cytochromového systému je dnes odhaleno téměř 80 ruzných polymorfismu. Takřka polovina z tohoto počtu byla odhalena v podskupině CYP2D6. Tento izoenzym metabolizuje asi 25–30 % léku, například b-blokátory, antiarytmika, antidepresiva či antipsychotika. Podle aktivity výsledného genotypu CYP2D6 je možné odlišit pomalé metabolizátory se dvěma nefunkčními alelami, rychlé metabolizátory a ultrarychlé metabolizátory. U pomalých metabolizátoru, tvořících 6–10 % naší populace, dochází ke kumulaci, k prodlouženému účinku léku a častějším nežádoucím účinkum [21]. Popsány jsou např. toxické hladiny propafenonu či mexiletinu s arytmiemi či zvracením.

Podobná situace je rovněž u CYP2C9, metabolizujícího například warfarin, losartan nebo nesteroidní antirevmatika. Zde jsou identifikovány tři alely vedoucí ke snížené aktivitě systému. Genotypy nesoucí například alelu CYP2C9*2 a CYP2C9*3 mají zásadní význam, neboť vedou k 5-, resp. 27násobnému snížení clerance warfarinu ve srovnání s běžnou alelou. Kumulace warfarinu je u těchto osob spojena s častými krvácivými komplikacemi [21]. Frekvence výskytu těchto genotypu je přitom v naší populaci častá, typ CYP2C9*2 se objevuje asi u 10–20 % jedincu a typ CYP2C9*3 u 6–9%.

Zajímavý, i když pro kardiologa méně duležitý, je polymorfismus CYP2C19. Tento izoenzym metabolizuje například diazepam či řadu antiulceróz. U pomalých metabolizátoru (3–5 % naší populace) se například prodlužuje poločas účinku diazepamu na 80 hodin proti 20 hodinám v běžné populaci. U omeprazolu například kumulace hladiny u pomalých metabolizátoru vede ke 100% eradikaci Helicobacter pylori proti jen 29% eradikaci u metabolizátoru rychlých [22].

Polymorfismus transferáz

Acetylační polymorfismus je dalším příkladem variability metabolického systému. Konjugační jaterní enzym N-acetyltransferáza katalyzuje N-acetylaci, zpravidla deaktivaci či O-acetylaci, obvykle aktivaci řady karcinogenu, heterocyklických aminu i léčiv. Fenotyp s pomalou acetylací (40–70 % populace) je spojen s častými toxickými projevy například hydralazinu, propafenonu či isoniazidu. Naopak rychlý fenotyp muže vyústit v nedostatečný účinek. Situace je však složitější. Například u antiarytmika I. třídy procainamidu dochází při fenotypu s rychlým metabolismem k masivní konverzi na N-acetylprocainamid, který má naopak účinek antiarytmika III. třídy. Jeho supraterapeutická hladina muže vyústit v prodloužení intervalu QT a k navození komorových arytmií [21].

Ukazuje se také, že u pomalých acetylátoru se objevuje vyšší riziko nádorového onemocnění [23]. Spekuluje se, že příčinou by mohla být delší expozice karcinogenum při jejich pomalé deaktivaci.

Polymorfismus transportních mechanismu

Polymorfismus se uplatňuje také v resorpci, aktivaci a degradaci léčiv určených k terapii srdečního selhání. Typickým příkladem je digoxin. Ten je substrátem pro P-glykoprotein (P-gp), tj. ATP dependentní pumpu kontrolující vstřebávání a vylučování řady léku. Je přítomná v epitelu střevním, proximálního tubulu ledvin, jater a v neurogliích hematoencefalické bariéry. Polymorfismus T/T proteinu P, který je spojen s dvojnásobnou aktivitou P-gp, výrazně zvyšuje vstřebávání digoxinu [24]. Nositelé této alely by tak měli dostávat řádově poloviční dávky léčiv, které jsou substrátem pro P-gp.

Závěr

Jaký je praktický dopad těchto poznatku? Zatím ještě nenastalo období „zlatého rozkvětu" farmakogenomiky. V současné době se intenzivně prověřují často kontroverzní nálezy polymorfismu v oblasti etiopatogeneze chorob. Mnohem dále je však praktické uplatnění v oblasti metabolismu léčiv. Zde je již řada laboratoří schopna rutinně stanovit genotyp metabolizátoru a jsou zprávy o testování kitu na klinické stanovení polymorfismu CYP2D6. O potřebě analýzy genomu a rozvoje oboru svědčí i slova profesora Eugena Braunwalda v jeho úvodní přednášce na 52. výročním setkání členu ACC v březnu 2003 v Chicagu, kde právě uvedení poznatku farmakogenomiky do praxe pokládá za největší výzvu medicíny pro následující léta.