Mobilizace kmenových krvetvorných buněk

Jak už bylo uvedeno, autologní transplantace krvetvorných buněk po vysokodávkované chemoterapii jsou standardní součástí léčby především u pacientů s mnohočetným myelomem a s vysoce rizikovými lymfomy, respektive chemosenzitivními relapsy lymfomů. Úspěšnost procedury a její mortalita jsou velmi významně ovlivněny kvalitou autotransplantátu, a tedy množstvím reinfundovaných krvetvorných buněk. Zdá se, že vyšší dávky transplantovaných krvetvorných buněk nejenom zlepšují parametry obnovy krvetvorby, ale rovněž prodlužují celkovou dobu přežití pacientů [11].

Klíčem k získání kvalitního transplantátu je mobilizace krvetvorných buněk, tzn. jejich vyplavení či vyplavování do periferní krve, kde se jejich koncentrace zvyšuje o 2–4 řády. V současnosti se mobilizací rozumí nejenom vlastní vyplavování progenitorů do krve, ale tento pojem zahrnuje celý proces začínající prvním podáním mobilizační léčby a končící posledním odběrem PBSC (peripheral blood stem cells) čili krvetvorných kmenových buněk periferní krve. Cílem mobilizace, a tedy základním předpokladem úspěšného odběru PBSC, je dosažení určité minimální koncentrace progenitorových buněk krvetvorby v krvi na takovou dobu, aby bylo možné odebrat pomocí aferézy kvalitní nebo alespoň bezpečný transplantát. Za nejnižší koncentraci CD34+ buněk, při níž se doporučuje zahájit odběr, se považuje 15 CD34+ buněk v jednom mikrolitru krve, i když za určitých okolností jsou aferézy prováděny i při nižších koncentracích. Pokud pacient nebo i dárce nedosáhnou tohoto limitu vyplavování progenitorů krvetvorby, pak jej označujeme anglickým termínem „poor mobilizer“ neboli skromný či chudý vyplavovač.

Transplantát považujeme za bezpečný v tom případě, že jeho podání po myeloablativní terapii zajistí plnou a trvalou obnovu krvetvorby ve všech řadách buněk během přiměřené doby, tj. přibližně za 20 dní od transplantace. Přitom se do jisté míry toleruje pomalejší normalizace trombopoezy, kdy dosažení koncentrace krevních destiček vyšší než 50 x 109/l může trvat poněkud déle. Díky určitému sjednocení metod kvantifikace CD34+ buněk, včetně různých programů mezilaboratorních kontrol apod., je za bezpečný považován autologní transplantát PBSC v případě, že obsahuje více než 2 x 106 CD34+ buněk/kg hmotnosti pacienta. S vyšším počtem CD34+ buněk se doba do obnovy krvetvorby (do přihojení) může poněkud zkrátit, ale tento efekt mizí při dávce přibližně 4–6 x 106 CD34+ buněk/kg a dávky vyšší již rychlost přihojení a ani jeho kvalitu dále neovlivní.

Kromě dosažení minimální koncentrace CD34+ buněk v krvi existují i další podmínky úspěšného sběru transplantátu. Koncentrace vyplavených krvetvorných buněk totiž musí být nejenom dostatečně vysoká, ale vyplavování musí také trvat dostatečně dlouhou dobu. Hovoříme o tzv. odběrovém oknu (harvest window), během kterého je možné či smysluplné aferézy provádět. Délka odběrového okna musí být dostatečně dlouhá zejména v případech, kdy je dosažená koncentrace CD34+ buněk nízká, a je proto nutné provést více aferéz ve více dnech. Odběrové okno musí být také do jisté míry předvídatelné, protože v opačném případě nemusíme ideální okamžik pro zahájení odběru zachytit, a pokud je okno krátké a mobilizace slabší, nemusí být získání bezpečného transplantátu úspěšné. Vyplavování krvetvorných buněk během odběrového okna by také mělo být setrvalé, jinými slovy, CD34+ buňky odebírané z krve při aferéze by se měly z poolu v kostní dřeni průběžně doplňovat, protože v opačném případě dochází opět k výraznému snížení výtěžnosti odběru. Jak je zřejmé, je na mobilizaci kladeno nemálo nároků. A navíc, optimální mobilizace má být dostatečně účinná i u starších a předléčených pacientů.

V praxi se dosud uplatňovaly téměř výhradně dvě základní strategie mobilizace: 1) mobilizace pomocí aplikace cytokinů, bez použití chemoterapie, 2) podání tzv. mobilizační chemoterapie s následnou aplikací cytokinů. Ostatní přístupy se používaly zcela ojediněle nebo se z různých příčin příliš neosvědčily.

Zlatým standardem mobilizace pomocí samotných cytokinů je podávání G-CSF, nejčastěji v dávce 10 mg/kg/den 1krát denně ráno. K maximálnímu vyplavení HSC dochází 5. a 6. den od zahájení podávání G-CSF. Existují různé modifikace tohoto postupu, například rozdělení denní dávky na ranní a večerní podání, přičemž je dosahováno vyšších koncentrací CD34+ buněk v krvi, a tedy i vyšších výtěžností sběrů. Tento postup je vyvážen o něco výraznějšími nežádoucími účinky G-CSF, projevujícími se zejména bolestmi skeletu, hlavy a svalů [12]. Další běžnou modifikací je vyšší dávka G-CSF (12–16 mg/kg/den), která se obvykle indikuje u více předléčených pacientů, případně u starších alogenních dárců.

Zlatým standardem mobilizace pomocí chemoterapie je podání střední dávky cyklofosfamidu (2–5 g/m2) následované každodenní podkožní aplikací 5–10 mg/kg/den G-CSF v jedné denní ranní dávce. Rozdělení vyšší denní dávky G-CSF (10 mg/kg/ den) do dvou aplikací přibližně po 12 hodinách (ráno a večer) opět dále zvýší mobilizační potenciál tohoto postupu. Podobně vyšší dávka cyklofosfamidu mobilizuje lépe než dávka nižší [13]. Mobilizační potenciál metody s využitím cyklofosfamidu a G-CSF je prokazatelně a zřetelně vyšší než při podávání samotného G-CSF [14]. Tento princip platí obecně a lze říci, že výtěžnost sběru PBSC při mobilizaci pomocí myelosupresivní chemoterapie (nejčastěji cyklofosfamidu, etoposidu, antracyklinů či paklitaxelu) s následným podáváním G-CSF je přibližně 2,5krát vyšší v porovnání se samotným G-CSF [15].

Na rozdíl od podávání samotného G-CSF, kdy je odběrové okno předem přesně známo, je pro správné načasování zahájení odběrů u mobilizace pomocí chemoterapie a G-CSF velmi vhodné denně monitorovat ranní krevní obraz v době vzestupu leukocytů z tzv. nadiru. Vzestup koncentrace CD34+ buněk obvykle sleduje vzestup koncentrace leukocytů a vyplavování progenitorů vrcholí většinou 2. až 3. den vyplavování, kdy jejich koncentrace v krvi dosahuje maxima. Schopnost mobilizace je velmi různorodá a interindividuální rozdíly v dosahovaných koncentracích progenitorů v krvi mohou být obrovské. Obvyklá koncentrace CD34+ buněk v krvi se sice pohybuje řádově v desítkách na mikrolitr, ale sami jsme opakovaně zaznamenali hodnoty přes 1000/ml. Problémy samozřejmě nepřináší situace, kdy pacient či dárce vyplavuje nezvykle velké množství progenitorů, ale naopak situace, kdy je vyplavení nedostatečné a pacient, eventuálně dárce, patří do skupiny tzv. poor mobilizerů.

GM-CSF představuje první cytokin používaný k mobilizaci krvetvorných buněk. Tento cytokin indukuje mobilizaci především stimulací proliferace a diferenciace hematopoetických progenitorů. Mobilizace samotným GM-CSF má však malou účinnost a výtěžnost odběrů CD34+ buněk je po jeho podání poměrně nízká a obvykle neuspokojivá, zejména ve srovnání s G-CSF [18]. Aplikace GM-CSF po mobilizační chemoterapii vede sice k lepšímu vyplavování CD34+ buněk než v případě použití GM-CSF v monoterapii, ale ve srovnání s G-CSF je mobilizace stále zřetelně horší. GM-CSF má přitom více nežádoucích účinků, které jsou ve srovnání s G-CSF navíc závažnější [19, 20]. Z těchto důvodů se v současnosti GM-CSF pro mobilizaci prakticky nepoužívá.

Aplikace G-CSF vede ke kvalitní mobilizaci jak při použití v monoterapii, tak v návaznosti na myelosupresivní chemoterapii. Mechanismy mobilizace při podávání G-CSF jsou přitom nepřímé. V kostní dřeni se zvyšuje počet progenitorů zadaných do granulocytární linie, a tedy i počet vyzrávajících granulocytárních prekurzorů, postupně i granulocytů. Z těchto buněk se v mikroprostředí krvetvorby uvolňují různé enzymy, zejména elastáza a různé proteázy, včetně matrix-metaloproteinázy 9 a katepsinu D. Výsledkem je vystupňovaná degradace adhezních molekul (hlavně VCAM-1, c-kit, CXCR4 a SDF-1), a tedy snížení adheze hematopoetických progenitorů ke stromatu kostní dřeně, což vede k jejich mobilizaci do periferní krve. G-CSF navíc snižuje aktivitu osteoblastů a expresi SDF-1 a na druhé straně zvyšuje aktivitu osteoklastů. Výsledkem je opět vystupňovaná mobilizace progenitorů krvetvorby do periferní krve [11, 21]. Účinnost G-CSF byla prokázána v řadě prací, vedlejší účinky jsou vcelku mírné, i když časté, a G-CSF se tak stal právem standardně používanou mobilizační látkou jak u pacientů, tak u zdravých dárců.

Základním a nejdůležitějším zástupcem této skupiny je plerixafor, známý také pod starším označením AMD3100. Plerixafor je reverzibilní antagonista, či spíše parciální agonista, receptoru CXCR4 (obr. 1). Tento receptor je důležitým koreceptorem umožňujícím vstup HIV do CD34+ lymfocytů a plerixafor byl vlastně původně vyvíjen pro prevenci a léčbu HIV. Z pohledu fyziologie a mobilizace je CXCR4 především specifickým receptorem pro SDF-1, a jak už bylo uvedeno výše, vazebná interakce mezi SDF-1 a CXCR4 hraje jednu z nejdůležitějších úloh při udržování hematopoetických progenitorů a kmenových buněk krvetvorby v mikroprostředí kostní dřeně. Blokáda této vazby vede k rychlé a poměrně masivní mobilizaci krvetvorných buněk. Plerixafor představuje derivát bicyklamu s malou molekulou. Podání plerixaforu v monoterapii vede k mírné leukocytóze a vyplavení CD34+ buněk [28]. Ve studiích fáze II byl plerixafor podáván již spolu s G-CSF a ukázalo se, že dochází k velmi dobré mobilizaci CD34+ buněk jak u pacientů s lymfomy, tak u pacientů s mnohočetným myelomem [29, 30]. Nejcennější je podání plerixaforu u tzv. poor mobilizer pacientů, u nichž obvyklá mobilizace s použitím G-CSF nebo chemoterapie a G-CSF selhala. Druhá mobilizace ve schématu G-CSF 10 mg/kg/den v jedné ranní denní dávce podávané ode dne 1 do ukončení sběru v kombinaci s plerixaforem v dávce 240 mg/kg/den podávaným ode dne 4 v jedné denní dávce aplikované okolo 22. hodiny vede k dostatečnému vyplavení CD34+ buněk, a tedy ke sběru bezpečného transplantátu PBSC u více než 75 % pacientů, u nichž první standardní mobilizace selhala [31, 32].

Použití plerixaforu je velmi slibné i v případě první mobilizace. Současný standardní model mobilizace u většiny pacientů zahrnuje podání mobilizační chemoterapie, která je provázena různými nežádoucími účinky, zejména pancytopenií a infekčními komplikacemi. Odběrové okno se u jednotlivých pacientů obvykle poněkud liší a odběry není možno předem načasovat, proto je nutné provádět pravidelné laboratorní kontroly. To ve svém důsledku s sebou nese prodloužení hospitalizací a sekundární náklady. Navíc standardní model mobilizace (chemoterapie + G-CSF) stále asi u 5–15 % pacientů selhává a tito pacienti by nakonec měli být remobilizováni právě s použitím plerixaforu. V poslední době také narůstá podíl tzv. poor mobilizerů, protože se v hojnější míře používají látky, které s mobilizací interferují a snižují šanci na kvalitní vyplavení progenitorů krvetvorby při běžně používaných postupech. Mezi tyto látky lze zařadit především thalidomid a lenalidomid [33, 34]. Ze starších léků negativně ovlivňujících mobilizaci uveďme především busulfan a melfalan, které se však již v primoléčbě pacientů připravovaných na autologní transplantaci nepoužívají, a dále BCNU, prokarbazin a především fludarabin, jenž se hojně používá u pacientů s lymfomy [35]. První studie zkoumající účinnost G-CSF v kombinaci s plerixaforem jako primární mobilizace jsou již k dispozici a dosažené výsledky jsou velmi dobré [36, 37]. Širšímu využití plerixaforu při mobilizacích nyní spíše brání poměrně vysoká cena tohoto přípravku, již registrovaného i v České republice.

V posledních dvou letech se konečně po dlouhé době rozvířily poměrně stojaté vody problematiky mobilizací a odběru krvetvorných buněk. Ustálený model standardní mobilizace (G-CSF v monoterapii nebo G-CSF v návaznosti na podání myelosupresivní chemoterapie), který se v uplynulých 15 letech v podstatě nezměnil, přestože u nezanedbatelné části pacientů – především u těch intenzivněji předléčených – selhává, se sice nadále zásadněji nemění, ale na druhé straně jsme se dočkali velmi významné inovace. Touto inovací se stala dostupnost plerixaforu, parciálního agonisty receptoru CXCR4, jehož podání v kombinaci s G-CSF vede u naprosté většiny pacientů k velmi kvalitní a predikovatelné mobilizaci CD34+ buněk. Největší výhodou plerixaforu je pak velmi vysoká účinnost i ve skupině pacientů, u kterých standardní postupy nevedly k uspokojivé mobilizaci, a tedy k získání bezpečného transplantátu. Tito pacienti, které řadíme do kategorie označované jako „poor mobilizers“, mají nyní šanci na odběr suficientního transplantátu, což jim následně umožní absolvovat plnohodnotnou léčbu včetně vysokodávkované chemoterapie s autologní transplantací krvetvorných buněk. Je navíc velmi pravděpodobné, že se s lepší dostupností plerixaforu do jisté míry změní i standardní model mobilizace ve smyslu jeho posunu do ambulantní léčby, což by jistě přivítali nejenom zdravotníci, ale také pacienti. Ve světle těchto nastupujících změn se pak již můžeme pouze těšit, co nového přinesou v současné době vyvíjené a testované látky, které slibují ještě výraznější a rychlejší mobilizaci. Nelze vyloučit, že se v budoucnosti dočkáme situace, kdy pacient absolvuje celý proces mobilizace a odběru krvetvorných buněk během jednoho dne.