Okrelizumab prokázal vysokou účinnost v léčbě roztroušené sklerózy. Jaké jsou imunobiologické základy jeho klinické efektivity?

Souhrn:
Krejsek J. Okrelizumab prokázal vysokou účinnost v léčbě roztroušené sklerózy. Jaké jsou imunobiologické základy jeho klinické efektivity? Remedia 2020; 30: 305–312.
Roztroušená skleróza mozkomíšní (RS) je imunopatologická neurodegenerativní nemoc, v jejíž patofyziologii byla až donedávna zdůrazňována klíčová úloha abnormálně polarizovaných subsetů T lymfocytů Th1 a Th17. B lymfocytární systém nebyl v RS považován za podstatnou složku poškozujícího zánětu. Nyní je experimentálně doloženo a potvrzeno výsledky klinických studií, že B lymfocyty jsou naopak velmi podstatnou součástí imunopatogeneze RS. B lymfocyty slouží jako vysoce efektivní buňky prezentující antigeny T lymfocytům. V poškozujícím zánětu stimulují preferenčně abnormální polarizaci T lymfocytů. V CNS byly prokázány organizované lymfatické struktury, které vznikají klonální expanzí B lymfocytů stimulovanou dosud nepoznanými antigeny. Po antigenní stimulaci B lymfocytů vyzrávají i lokálně ve strukturách CNS v plazmatické buňky, které tvoří autoprotilátky přímo se podílející na poškozování myelinových obalů neuronů. Je doložena cirkulace B lymfocytů mezi periferními sekundárními lymfatickými orgány a CNS. Jejich pohyb je regulován gradienty chemokinů a sfingosin‑fosfátu. Biologika, která cílí na molekulu CD20, specificky vyjádřenou na zralých B lymfocytech, prokázala vynikající účinnost v léčbě RS. Výhodou této léčby je její dobrý bezpečnostní profil.

Summary:
Krejsek J. Ocrelizumab is highly effective in the treatment of multiple sclerosis. What is the immunobiological background of its clinical effectivity? Remedia 2020; 30: 305–312.
Multiple sclerosis (MS) is an immunopathological neurodegenerative disease. Up to recently, the key role in MS was being assigned to the abnormally polarized Th1 and Th17 subsets of T cells. The participation of B cell system in damaging inflammation of MS was not considered important. Contrarily, it has been evidenced recently, both experimentally and clinically, that B cells are an integral part of the immunopathogenesis of MS. B cells are highly effective in the presentation of antigens to T cells. In damaging inflammation, they preferentially stimulate abnormal polarization of T cells. A presence of highly organised lymphatic structures in the central nervous system (CNS) has been described, originating from clonal expansion of B cells stimulated by still unknown antigens. After antigen stimulation, B cells terminally differentiate into plasma cells locally in the CNS structures, secreting autoantibodies participating on the damage of neuronal myelin sheaths. There is evidence of active circulation of B cells between peripheral secondary lymphoid organs and CNS. Their oriented movement is regulated by gradients of chemokines and sphingosinephosphates. Biological therapy of MS targeting CD20 molecule specifically expressed on mature B cells clearly demonstrated an excellent clinical response, with favorable safety profile.

Key words: multiple sclerosis, B cells, molecule CD20, biological therapy, ocrelizumab

Roztroušená skleróza mozkomíšní (RS) je závažné imunopatologické a neurodegenerativní onemocnění centrální nervové soustavy (CNS). Naše populace patří mezi nejpostiženější. Patogeneze RS je popsána pouze zčásti, přestože toto onemocnění je studováno na nejvyšší úrovni již několik desítek let. K dispozici je i experimentální zvířecí model. U geneticky disponovaných myší (jiných zvířat) je vyvolána imunopatologická experimentální autoimunitní encefalitida (EAE), která se svými klinickými projevy v mnohém podobá RS. Zatímco v minulosti se k indukci EAE využívaly nedefinované extrakty mozkové tkáně, moderní experimenty využívají definované antigeny (epitopy) odvozené od složek myelinových obalů, např. myelinového bazického proteinu (myeline basic protein, MBP). Ty mají být podle našich představ rozpoznány autoreaktivními T lymfocyty. K jejich rozpoznání prostřednictvím T buněčných receptorů (T cell receptor, TcR) je nezbytná jejich vazba na molekuly HLA buněk II. třídy (lidský leukocytární antigen, human leukocyte antigen) schopných zpracovat a prezentovat antigeny T lymfocytům. Nejpotentnějšími prezentujícími buňkami jsou různé tkáňově lokalizované subsety dendritických buněk, které musejí být aktivovány prostřednictvím receptorů PRR (pattern recognition receptors). Proto nepřekvapí, že EAE je indukována pouze tehdy, pokud jsou encefalitogenní peptidy podány v kompletním Freundovu adjuvans. To je tvořeno olejovou emulzí živého vakcinačního kmene M. bovis BCG, který má mimořádný potenciál stimulovat složky vrozené imunity prostřednictvím zmíněných receptorů PRR. Tyto nálezy jasně dokládají zásadní podíl vrozené imunity a pravděpodobně i dalších složek zánětu neimunní povahy v rozvoji EAE. Zatím však lze uzavřít, že v chápání patogeneze RS stále převládá důraz na specifickou T (B) lymfocytární imunitu.

Roztroušená skleróza je jednoznačně multifaktoriální onemocnění s určitou genetickou predispozicí, která není příliš výrazná. Z neznámých příčin, pravděpodobně pod vlivem faktorů vnějšího světa, mezi něž patří zřejmě některé virové infekce, dochází k prolomení homeostatických regulací imunitní soustavy. Z experimentů EAE a nově také z nálezů získaných u nemocných s RS je dokládáno, že ztráta homeostatických regulací může být spojena s abnormitami v osídlení střevní sliznice složitým mikrobiálním společenstvím označovaným jako mikrobiota. V modelu bezmikrobních zvířat totiž nelze EAE vůbec vyvolat. Po osídlení mikrobiotou je schopnost indukovat EAE obnovena. Je to dobrý příklad, jak obtížně popsatelné jsou příčiny vzniku a rozvoje RS.

Výsledkem je poškozující zánět, jehož cílem jsou již zmíněné obalové struktury nervových vláken. Imunopatogeneze je však komplexnější a zahrnuje i další buněčné struktury CNS, zvláště astrocyty a mikroglie. Na základě rozsáhlých experimentálních i klinických výzkumů je v současné době obecně přijímáno, že ústřední úlohu v poškozujícím zánětu u nemocných s RS sehrávají abnormálně funkčně polarizované subsety T lymfocytů Th1 a Th17, které podle stávajícího konceptu považujeme za klíčovou součást poškozujícího zánětu. Ztráta homeostatických regulací je charakterizována nižší aktivitou subsetu regulačních T (Treg) lymfocytů [1]. Tento koncept je nepochybně alespoň zčásti pravdivý. Důkazem jsou účinné léčebné zásahy rekombinantními interferony beta a glatiramer acetátem, používané již přibližně 25 let k léčbě relabující remitující RS (RR RS), které jsou založeny především na modulaci T lymfocytární imunity. Bylo překvapením, když před několika lety klinické experimenty prokázaly výbornou účinnost léčebných zásahů zprostředkovaných biologickou terapií cílící na B lymfocyty. Konkrétně se jedná o použití monoklonálních protilátek reagujících s molekulou CD20 vyjádřenou na zralých B lymfocytech. Tyto nové poznatky přinesly zcela nový pohled na imunopatogenetické mechanismy RS [2].

Už desítky let je známo, že v likvoru nemocných s RS je možné detekovat tzv. oligoklonální proužky imunoglobulinů. Průkaz oligoklonálních imunoglobulinů v likvoru dlouhá léta byl a nyní je znovu považován za dobrý pomocný diagnostický marker u nemocných s RS. Přítomnost oligoklonálních pásů v likvoru a další nálezy, např. v transkriptomu B lymfocytů v kompartmentu CNS, jasně ukazují na intratekální syntézu těchto protilátek. Přes dlouholeté úsilí nebyly nalezeny interpretačně významné terče těchto oligoklonálních protilátek. Většina z nich reaguje s různými strukturami CNS. To je interpretováno buď jako epifenomén, který ukazuje na imunitní odpověď na poškozené struktury mozku, nebo je přítomnost těchto protilátek vykládána jako jeden z mechanismů, jimiž se imunitní systém podílí na „úklidu“ v kompartmentu CNS. Jsou však i důkazy, že intratekálně tvořené imunoglobuliny obsahují specifické protilátky re­agu­jí­cí s antigeny např. virů spalniček, zarděnek nebo varicely. Nyní by bylo chybné tvrdit, že protilátková aktivita v CNS u nemocných s RS je pouhým epifenoménem. Jsou jasné důkazy, že autoprotilátky se váží na strukturní elementy v mozku, např. na myelinové pochvy, oligodendrocyty, astrocyty. Byla prokázána kolokalizace protilátek a aktivovaných složek komplementového systému a také cytotoxických buněk. Oba tyto mechanismy jsou prokazatelně zapojeny do efektorových fází poškozujícího zánětu u nemocných s RS [3].

Je pravděpodobné, že aktivní zapojení B lymfocytů do poškozujícího zánětu u nemocných s RS je komplexnější a B lymfocyty se nepochybně podílejí i na iniciačních fázích poškozujícího zánětu. B lymfocyty totiž prokazatelně slouží jako mimořádně efektivní buňky, které jsou schopny identifikovat vzory DAMP/PAMP (molekulární vzory asociované s poškozením/s patogenem, damage associated molecular patterns/pathogen associated molecular patterns) prostřednictvím receptorů PRR. Na rozdíl od jiných prezentujících buněk navíc rozpoznávají vysoce selektivně nativní antigeny prostřednictvím B buněčných receptorů (B cell receptor, BcR). Následně jsou schopny tyto antigeny internalizovat a nitrobuněčně zpracovat. Vzniklé antigenní peptidy prezentují v kontextu molekul HLA II. třídy T lymfocytům. Mohou se tedy jednoznačně podílet na aktivaci, klonální expanzi a funkční polarizaci autoreaktivních T lymfocytů ve strukturách CNS. Úloha B lymfocytů jako prezentujících buněk je ve strukturách CNS jednoznačná, protože se zde nenacházejí dendritické buňky a mikroglie mají pouze velmi omezený potenciál zpracovat a prezentovat antigeny T lymfocytům. Podstatná je také schopnost aktivovaných B lymfocytů vstupovat do struktur CNS a vystupovat z nich přes hematoencefalickou bariéru a další strategická rozhraní, která oddělují CNS od periferie. B lymfocyty, které v sekundárních lymfatických orgánech rozpoznaly antigeny, je mohou vnášet do CNS a tam je prezentovat T lymfocytům.

B lymfocyty jsou vydatným zdrojem prozánětlivých cytokinů, např. tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNFα), faktoru stimulujícího kolonie granulocytů a makrofágů (GM CSF) a chemokinů. Jejich prostřednictvím jsou zapojeny do samotné buněčné organizace poškozujícího zánětu u nemocných s RS. Poskytují také růstové faktory a anti­apo­pto­tic­ké podněty nutné pro přežívání imunitních buněk, které jsou součástí poškozujícího zánětu u nemocných s RS. Diferenciace a proliferace B lymfocytů je regulována řadou působků. Za jeden z nejvýznamnějších cytokinů, který je nezbytný pro tyto aktivity B lymfocytů, je považován BAFF (B cell activating factor). Strukturně patří do rodiny TNFα. Vyskytuje se buď jako membránově vázaný, nebo v solubilní podobě v tekutinách a je tvořen především buňkami vrozené imunity. B lymfocyty ho rozpoznávají prostřednictvím receptoru BAFF (BAFFR). Mimo jiné brání apoptóze B lymfocytů a stimuluje jejich diferenciaci např. po předchozí depleční terapii [4].

B lymfocyty jsou detekovány v demyelinizačních lézích od počátečních až do pokročilých stadií RS. Je zajímavé, že B lymfocyty jsou v největším počtu přítomny v aktivních lézích nemocných s RR RS v porovnání s inaktivními lézemi a také při porovnání s pacienty se sekundárně progresivní RS (SP RS) nebo s primárně progresivní RS (PP RS). B lymfocyty se nacházejí v perivaskulárních lézích a rovněž v subarachnoidálním prostoru. V parenchymu je jejich přítomnost velmi nízká. U pacientů s nejzávažnější formou RS, primárně progresivní, byly post mortem prokázány zorganizované tzv. terciární lymfatické struktury na meningách. Terciární lymfatické struktury jsou místem lokální odpovědi B lymfocytů na antigenní podněty. V těchto strukturách jsou přítomny folikulární dendritické buňky a také folikulární T lymfocyty Tfh, poskytující nejúčinnější regulační podporu CD20+ B lymfocytům stimulovaným antigenem. B lymfocyty v nich po antigenní stimulaci klonálně expandují a terminálně se diferencují do plazmatických buněk, které lokálně tvoří imunoglobuliny. Meningeální agregáty CD20+ B lymfocytů a T lymfocytů byly nalezeny také u nemocných s RR RS a korelují se stupněm kortikální demyelinizace. Tyto nálezy naznačují společný jmenovatel mezi přítomností patologických folikulů B lymfocytů na meningách a kortikální patologií ve všech formách RS. Unikátní mikroenvironment podporuje klonální expanzi, terminální diferenciaci a přežívání B lymfocytů v CNS. Podílí se na tom již zmíněný růstový faktor B lymfocytů označovaný jako BAFF. Akumulaci B lymfocytů v této nice zajišťují cytokiny CXCL 12 a CXCL 13, jejichž tvorba je v zánětlivé lézi CNS zvýšena. Pokles koncentrace CXCL 13 v likvoru koreluje s dobrou klinickou odpovědí na biologickou terapii anti CD20.

Podrobnou analýzou B lymfocytů přítomných v krvi, likvoru a také v mozkových tkáních pacientů s RS bylo prokázáno, že protilátky imunoglobulinu G (IgG) v likvoru vykazují omezené využití určitých genových segmentů V_H a mají známky somatické hypermutace. To naznačuje (oligo)klonální původ v B lymfocytech, které byly expandovány v CNS zatím neznámými antigenními podněty. Porovnáním profilů B lymfocytů a IgG v parenchymálních lézích, meningách, likvoru, lymfatických uzlinách a v krvi je dokládán aktivní přesun B lymfocytů mezi těmito kompartmenty. Klonálně expandující B lymfocyty přetrvávají v likvoru nemocných s RS léčených imunomodulační terapií [5].

Absolutní důkazy o zapojení B lymfocytů do patogeneze RS získáváme z klinicky prokázaného pozitivního efektu biologické terapie okrelizumabem. „Off label“ byl pro stejný účel využíván také rituximab. Obě biologika cílí na molekulu CD20 specificky vyjádřenou na zralých B lymfocytech. Klinický efekt u nemocných s RS vykazuje též biologikum alemtuzumab rozpoznávající molekulu CD52 vyjádřenou na řadě buněčných elementů imunitní soustavy, včetně B lymfocytů. Alemtuzumab však má v porovnání s okrelizumabem výrazně rizikový profil [6].

Diferenciace B lymfocytů

B lymfocyty patří k nejlépe prozkoumaným buněčným elementům imunitní soustavy. Množství poznatků, které o nich byly z různých pohledů získány, je ohromné. Studium B lymfocytů má celou řadu praktických výstupů směrem do klinické medicíny, diagnostické praxe a ovlivňuje zdraví lidí obecně. Zde se zaměříme pouze na stručné ozřejmení diferenciace B lymfocytů. B lymfocyty se vyvíjejí v primárních orgánech krvetvorby, tím po narození zůstává kostní dřeň. Jejich vývoj probíhá z kmenové buňky krvetvorby. Pro sledování diferenciačních procesů leukocytů je velmi výhodné a vysoce specifické stanovovat membránové nebo nitrobuněčné molekuly pomocí monoklonálních protilátek s vyhodnocením průtokovou cytometrií. Pro tyto účely byla vytvořena závazná nomenklatura leukocytárních znaků, kterou označujeme jako CD klasifikace. Každé molekule v ní přísluší určité pořadové číslo. Přiřazení znaku CD značí, že o této molekule víme prakticky vše. Kmenová buňka krvetvorby exprimuje znak CD34. Z ní se na základě aktuálních potřeb člověka vyvíjejí všechny větve krvetvorby. Na nejnižší diferenciační úrovni se od sebe odděluje lymfoidní a myeloidní vývojová větev. V rámci lymfoidní vývojové větve potom probíhá vývoj v oddělených větvích, které dávají vznik T lymfocytům a B lymfocytům. Velmi brzy v průběhu diferenciace exprimují prekurzory B lymfocytů membránový znak CD19, který je specifický pro B lymfocytární větev. V postupných dalších krocích, které probíhají bez přítomnosti antigenu, dochází ke komplexním změnám vyzrávajícího B lymfocytu. To se odráží na jeho imunobiologických vlastnostech. Postupně ztrácí znaky nezralosti a získává další B lymfocytární znaky, které si podrží až do stadia zralého B lymfocytu. Z těchto znaků můžeme zdůraznit především molekulu CD20, která bude předmětem bližší informace dále. Připomínáme však, že zralé B lymfocyty nesou řadu dalších znaků specifických pro B lymfocyty, jakými je např. již zmíněná molekula CD19 a dále CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40 a další. Podstatné pro vývoj B lymfocytů je uskutečnění tzv. přeskupení genových segmentů, jež kódují receptory pro antigen na B lymfocytech (BcR). Tento mimořádně komplexní imunobiologický fenomén zde nebudeme komentovat. Odkazujeme na jeho stručný popis v naší práci [7].

Úspěšné přeskupení genových segmentů vede k vyjádření receptoru pro antigen BcR na povrchu B lymfocytu. BcR je komplexní membránová struktura, jejíž rozpoznávací složkou je povrchový imunoglobulin IgM (IgD) asociovaný funkčně s dalšími membránovými strukturami, především s molekulami CD79a a CD79b. Přítomnost BcR definuje zralý B lymfocyt. Na této úrovni končí na antigenu nezávislý vývoj B lymfocytů, který vede k vytvoření ohromného repertoáru různých B lymfocytů s různými specificitami BcR, jimiž budou rozpoznávat rozmanité antigenní podněty. Základní repertoár B lymfocytů, podobně jako T lymfocytů, také zahrnuje autoreaktivní klony. Ty jsou následně v komplikovaných selekčních krocích za fyziologických podmínek likvidovány. U imunopatologických nemocí, v jejichž patologii jsou zapojeny B lymfocyty, platí, že tyto selekční procesy nejsou v plné míře účinné. V repertoáru B lymfocytů jsou zachovány autoreaktivní B lymfocyty. Tak tomu je zřejmě i u RS.

Další vývoj probíhá pouze u těch B lymfocytů, které prostřednictvím BcR rozpoznaly antigen, obdržely všechny další nutné podněty od kooperujících buněk, především od T lymfocytárních subsetů Tfh a Th2. K těmto procesům stimulovaným antigenem dochází v sekundárních lymfatických orgánech, především lymfatických uzlinách, slezině a jistě také v lymfoidní tkáni spojené se sliznicemi. Výsledkem je klonální expanze antigenem stimulovaných B lymfocytů, izotypové přepnutí, somatická mutace a jejich další postupná diferenciace, na jejímž konci stojí vznik plazmatických buněk. V průběhu této terminální diferenciace se proměňují imunobiologické vlastnosti B lymfocytů, které můžeme sledovat např. změnou membránových molekul. Velmi zjednodušeně lze konstatovat, že pan B lymfocytární znaky vyjádřené na zralých B lymfocytech, včetně CD20, jsou postupně ztráceny a na plně diferencovaných plazmatických buňkách se již tyto membránové struktury nevyskytují. Naopak, plazmatické buňky získávají jinou membránovou výbavu, která je pro ně typická, např. exprimují molekuly CD38 a CD138. K protilátkové odpovědi dochází i v terciárních lymfatických strukturách imunitní soustavy lokalizovaných u nemocných s RS především na meningách [8].

Zralé B lymfocyty jsou přesně regulovanými migračními procesy označovanými jako cílené osidlování (homing) z primárních orgánů imunitního systému, kde proběhla jejich diferenciace nezávislá na jejich antigenu, exportovány do lymfatických uzlin, sleziny a lymfatických tkání spojených se sliznicemi, především do Peyerových plátů sliznice tenkého střeva. V těchto tzv. sekundárních orgánech imunity jsou vytvořeny podmínky pro expozici B lymfocytů antigenním podnětům. Těmito orgány procházejí tělní tekutiny, tj. krev a lymfa, v nichž je přinášen antigenní materiál. B lymfocyty průběžně vcházejí do těchto orgánů a vycházejí z nich a recirkulují prostřednictvím specializovaného vysokého endotelu postkapilárních venul. Kontakt B lymfocytů s antigeny v různých sekundárních orgánech zajišťují odlišné buněčné typy. V lymfatických uzlinách jsou to především specializované makrofágy lokalizované v subkapsulární oblasti, kde zachycují antigeny z lymfy a zprostředkují kontakt s folikulárními B lymfocyty. Ve středu folikulů se nacházejí specializované folikulární dendritické buňky (fol­licular dendritic cell, FDC), které jsou mimořádně efektivní ve schopnosti zachycovat a prezentovat antigeny na svých dendritech. Na rozdíl od jiných prezentujících buněk nejsou FDC schopny antigeny internalizovat, a antigeny tak zůstávají v intaktní podobě, v níž jsou rozpoznávány B lymfocyty prostřednictvím BcR.

B lymfocyty jsou směrovány do lymfatických folikulů prostřednictvím chemokinů, především CXCL 13, který je tvořen právě FDC. B lymfocyty nesou receptor pro tento chemokin, konkrétně CXCR 5. Pokud se B lymfocyty v určitém časovém úseku nesetkají s antigenem, opouštějí sekundární lymfatické tkáně v gradientu sfingosin 1 fosfátu (S1P), který identifikují pomocí receptorů S1PR1. Z lymfatických uzlin a Peyerových plátů sliznice vstupují B lymfocyty do lymfatických cév, ze sleziny do krevních cév. Celý popsaný proces B lymfocyty opakují, dokud se nesetkají s antigenem.

U mnohých onemocnění, v jejichž patofyziologii se uplatňuje poškozující zánět, jsou v lézích prokazovány lymfatické struktury označované jako terciární lymfatické orgány. Byly prokázány např. v synoviálních tkáních nemocných s revmatoidní artritidou, v pokročilých aterosklerotických lézích. Jsou přítomny i ve strukturách CNS nemocných s RS.

Kognitivní signál B lymfocytům poskytuje rozpoznání antigenu prostřednictvím BcR. Zdůrazňujeme, že antigen je v tomto případě v nativní podobě a je představován relativně velkou molekulou několika desítek aminokyselin se zachovalou konformací. To je v naprostém protikladu k antigenům rozpoznávaným T lymfocyty. Zde se jedná o malé lineární peptidy (10‒20 aminokyselin), které musejí být poutány v molekulách HLA I. nebo II. třídy. Přesto samotné rozpoznání antigenu prostřednictvím BcR nestačí k aktivaci B lymfocytů. Musí se zapojit řada dalších membránových molekul, které označujeme jako kostimulační. Zdůrazníme úlohu různých receptorů PRR (např. z rodiny TLR, toll like receptor). Zapojují se také molekuly CD19, CD22, receptory pro Fc část imunoglobulinů a různé receptory pro složky komplementu. Cílem je dosáhnout dostatečné hodnoty nitrobuněčných signálů, které tyto receptory po obsazení svými ligandy konkrétnímu B lymfocytu poskytnou. Pokud je aktivace dosaženo, spouští se v daném B lymfocytu klonální expanze. Následují další diferenciační kroky, na jejichž konci je plazmatická buňka tvořící protilátky, které mají stejnou specificitu jako povrchový imunoglobulin BcR. Primárně probíhá tvorba protilátek v sekundárních lymfatických orgánech, zvláště v lymfatické tkáni spojené se sliznicemi. Zde se tvoří sekreční protilátky sIgA. Jejich produkce představuje přibližně 70 % celkové produkce imunoglobulinů. Jiný subset plazmatických buněk je definitivně kompartmentalizován v kostní dřeni. Je zajištěna také tvorba paměťových B lymfocytů. Vznikají i různě funkčně polarizované B lymfocyty,  např. subsetu Breg [9].

Relativně brzy v průběhu antigenem stimulované B lymfocytární odpovědi se rozvíjejí mechanismy aktivace B lymfocytů, které nejsou závislé na podpoře T lymfocytárního systému. Touto cestou jsou tvořeny protilátky třídy IgM, které mají relativně nízkou specificitu k danému antigenu. Výhodou je rychlost jejich tvorby a rovněž skutečnost, že protilátky třídy IgM jsou schopny silně aktivovat komplementový systém po vazbě na antigeny. Přitom nepronikají do tkání, a nehrozí tedy poškození vlastních struktur aktivovaným komplementem.

S časovým odstupem navazuje na toto „přemostění“ s přirozenými bariérami a vrozenou imunitou aktivita B lymfocytů vyžadující velmi komplexní interakce s T lymfocytárním systémem. K interakcím mezi T a B lymfocyty dochází v germinálních centrech. Zahrnují v přehledu procesy označované jako izotypové přepnutí, afinitní vyzrávání a tvorbu imunitní paměti. Podporu poskytuje subset T lymfocytů, který rozpoznal konkrétní antigen, v tomto případě prezentovaný B lymfocyty. Byl i jejich působením funkčně polarizován do subsetu Th2. T lymfocyty subsetu Th2 jsou v bezprostředním membránovém kontaktu s aktivovanými B lymfocyty. Tyto interakce jsou pro další vývoj B lymfocytů naprosto nezbytné. Pokud nejsou poskytnuty, antigenem aktivovaný B lymfocyt vstupuje do apoptózy a hyne.

Izotypovým přepnutím rozumíme genové přeskupení v oblasti genových segmentů kódujících konstantní část řetězců BcR (imunoglobulinů). Variabilní část řetězců vzniklých náhodným přeskupením VDJ genových segmentů určujících jejich specificitu se již nemění. Namísto genového segmentu Cµ, který sousedí v zárodečné DNA s přeskupenou oblastí VDJ, musí být přiřazen jiný genový segment, např. Cα. Tak vznikne specifická protilátka třídy IgA. Izotypové přepnutí regulují zejména interakce mezi molekulami CD40 B lymfocytů a molekulami CD40L (CD154) na aktivovaných T lymfocytech subsetu Th2. Ve hře jsou i další membránové interakce, jimiž se zde nebudeme zabývat. Proces se musí uskutečnit v cytokinovém mikroprostředí, v němž dominuje interleukin 4 (IL 4) tvořený právě T lymfocyty subsetu Th2.

B lymfocyt stimulovaný antigenem a podporovaný Th2 lymfocytem mění sekvenci aminokyselin ve vazebném místě BcR. Děje se tak v průběhu jeho klonální expanze. V ní vznikají B lymfocyty s vyšší afinitou k danému antigenu. Po několika krocích proliferace stimulované antigenem převládají B lymfocyty s vysokou afinitou svého BcR. Tuto vyšší afinitu si následně udržují v dalších diferenciačních krocích do stadia plazmatické buňky. Plazmatické buňky tvoří protilátky všech tříd s vysokou afinitou k danému antigenu. Je to dobře doloženo i z klinické praxe, kdy protilátky na konci infekčního onemocnění mají vyšší afinitu v porovnání s protilátkami tvořenými na počátku infekce. Popisované prospěšné vlastnosti, které získají B lymfocyty až po stimulaci antigenem, jsou uloženy do paměťových buněk. Následný kontakt s týmž podnětem vede velmi rychle k tvorbě izotypově přepnutých a vysoce specifických protilátek s velkým obranným potenciálem [10].

Exprese molekuly CD20 se v průběhu vyzrávání B lymfocytů zvyšuje a dosahuje nejvyšší denzity na úrovni zralého plně imunokompetentního B lymfocytu. Nevyskytuje se ani na kmenových buňkách krvetvorby, ani na plazmatických buňkách. Molekula CD20 je membránový fosfoprotein, který čtyřikrát prochází cytoplazmatickou membránou B lymfocytu. Patří strukturně mezi tzv. tetraspanové molekuly. Její přesná fyziologická úloha není známa. Vyskytuje se rovněž na nádorově změněných buňkách B lymfocytárního původu, tj. buněčných elementech B lymfoproliferativního onemocnění charakteru B nehodgkinského lymfomu (B NHL) nebo chronické lymfocytární leukemie (CLL). Právě B lymfocytární lymfoproliferativní onemocnění byla již v roce 1997 první klinickou indikací pro využití terapie anti CD20 humanizovanou protilátkou rituximabem. Indikační šíře biologické terapie anti CD20 byla postupně rozšiřována do léčby imunopatologických stavů. Jmenovat můžeme imunopatologie s převažující autoprotilátkovou aktivitou, jakými jsou revmatoidní artritida, systémový lupus erythematodes a některé typy vaskulitid. V neurologické indikaci je to např. myasthenia gravis a neuromyelitis optica [11].

Postupně byly vyvíjeny např. okrelizumab, obinutuzumab a další humanizované protilátky anti CD20, a rovněž humánní protilátky anti CD20, např. ofatumumab. Změn v konstrukci monoklonálních protilátek, které jsou žádoucí s ohledem na klinické aplikace, není dosahováno pouze výše uvedeným procesem, na jehož vrcholu je teoreticky plně humánní protilátka. Bylo prokázáno v experimentech in vitro i v klinických studiích, že srovnatelné a možná i výhodnější vlastnosti získávají monoklonální protilátky na základě manipulace se složením aminokyselin v tzv. pantové oblasti a manipulací s glykosylací v Fc části molekuly. Glykosylace je proces, kdy je protein záměrně upravován vazbou cukerných struktur, které mohou významným způsobem ovlivňovat jeho vlastnosti. Pantová oblast je část těžkého řetězce imunoglobulinů, která se rozevírá k Fab části a je klíčová pro sterické (prostorové) uspořádání molekuly, jež určuje vazebné vlastnosti protilátky s antigenními epitopy. Vhodnou úpravou cukerných zbytků na Fc části jsou cíleně ovlivněny interakce protilátky navázané na antigen s receptory pro Fc část IgG na cytotoxických buňkách, fagocytujících buňkách a tyto interakce také určují aktivaci komplementu. Zatím nejdále pokročila v tomto ohledu „optimalizace“ biologika anti CD20 okrelizumabu [12].

Okrelizumab je humanizovaná protilátka podtřídy IgG₁, která se váže stejně jako rituximab na velkou extracelulární smyčku molekuly CD20. Vazebný epitop je však odlišný od epitopu, který rozpoznává rituximab. V porovnání s rituximabem vazba okrelizumabu vede k silnější depleci B lymfocytů cestou buněčné cytotoxicity závislé na autoprotilátkách (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Aktivace komplementu je prostřednictvím této protilátky daleko slabší. To by mohlo být výhodou, protože při aktivaci komplementového systému vznikají prozánětlivé působky, které by mohly být součástí nežádoucích účinků aplikace okrelizumabu [13].

Aplikace okrelizumabu u nemocných s RS vede k rozsáhlým změnám parametrů imunitního systému. Pro lékaře, kteří obecně spojují obranné reakce především s přítomností protilátek a zprostředkovaně s přítomností B lymfocytů v periferní krvi, může být zarážející skutečnost, že léčba okrelizumabem s krátkým odstupem po aplikaci vede téměř k eliminaci B lymfocytů v periferní krvi. Tento fakt byl opakovaně doložen řadou klinických sledování. V nich však bylo také zjištěno, že deplece či výrazné snížení počtu B lymfocytů v periferní krvi nemocných s RS léčených okrelizumabem mohou být použity jako zástupný biomarker účinnosti terapie. Deplece či výrazné snížení počtu B lymfocytů v periferní krvi totiž zřetelně koreluje s klinickými parametry, jakými jsou EDSS (Expanded Disability Status Scale), ARR (annual relapse rate), a rovněž s aktivitou nemoci sledovanou pomocí magnetické rezonance. Ve všech těchto ukazatelích lze potvrdit pozitivní vliv léčby okrelizumabem v závislosti na snížení počtu B lymfocytů v periferní krvi [14].

Výrazné snížení počtu B lymfocytů, či dokonce jejich úplnou depleci v periferní krvi pacientů s RS léčených okrelizumabem je třeba posuzovat v kontextu širších znalostí, jako jsou kvantitativní poměry zastoupení B lymfocytů v různých tělních kompartmentech. Je doloženo, že v periferní krvi se nachází pouze několik procent populace B lymfocytů, se kterou pracuje imunitní systém člověka. Drtivá většina B lymfocytů je lokalizována v sekundárních lymfocytárních orgánech, tj. v uzlinách, slezině, a především v lymfatické tkáni spojené se sliznicemi. Nejsou dostupné údaje o tom, jak léčba okrelizumabem ovlivňuje takto kompartmentalizované B lymfocyty u člověka. Protože se jedná o velkou biomolekulu, nedochází s největší pravděpodobností k průniku okrelizumabu do lymfatických orgánů a zde přítomné B lymfocyty zřejmě nebudou významněji přímo ovlivňovány. Intravenózní aplikace okrelizumabu bude působit po omezenou dobu, protože imunoglobuliny mají relativně krátký poločas rozpadu. Z toho lze dovodit, že i B lymfocyty, které přirozeně regulovaně podle momentálních potřeb organismu vstupují do cévního řečiště ze sekundárních lymfatických orgánů, budou ovlivněny pouze po přechodnou dobu. Okrelizumab jistě nebude deplečně působit po celý interval mezi jednotlivými aplikacemi. V sekundárních lymfatických orgánech, zvláště slezině, jsou k dispozici rychle mobilizovatelné zralé B lymfocyty, které v případě infekčního podnětu zajistí dostatečnou úroveň protekce. V dlouhodobém horizontu je podstatné, že zůstává zachována kapacita časných vývojových stadií krvetvorby, včetně kmenových buněk. Z nich je zajišťována průběžná obnova B lymfopoezy. V porovnání s rychlou mobilizací imunokompetentních B lymfocytů ze sekundárních lymfatických orgánů, kterou lze odhadnout na hodiny, nejvýše dny, je obnova plné kompetence B lymfocytárního systému z časných stadií krvetvorby podstatně pomalejší, v řádu měsíců.

Léčba biologiky anti CD20 u nemocných s RS vede k poklesu koncentrace protilátek v periferní krvi k dolním fyziologickým hranicím. Léčba okrelizumabem nemůže mít z principu vliv na počet plazmatických buněk, které protilátky tvoří, protože nenesou molekulu CD20. Pro koncentrace protilátek v krvi, především třídy IgG, platí stejné jako pro počty B lymfocytů. I zde je obrovská interindividuální variabilita. Normální hodnoty IgG dospělých v naší imunologické laboratoři se pohybují v rozmezí 7,30–19,50 g/l. Z vlastních zkušeností z péče o pacienty s primární imunodeficiencí (CVID), která je charakterizována především výrazně sníženou schopností tvorby protilátek IgG, víme, že klinické projevy lze čekat až při hodnotách < 1–2 g/l. Z uvedeného je zřejmé, že se u pacientů léčených okrelizumabem nemusíme obávat negativních dopadů na protektivní protilátkovou specifickou imunitu. To nakonec jasně dokládají i data získaná ze sledování velkých souborů pacientů s RS léčených okrelizumabem. Nebyly zaznamenány život ohrožující infekční komplikace. V současnosti – v souvislosti s obavami z infekce SARS CoV 2 – je třeba zdůraznit, že infekční komplikace provázející léčbu okrelizumabem jsou způsobeny bakteriálními patogeny, ne viry. Léčba okrelizumabem je považována za bezpečnou i v kontextu možnosti rozvoje nádorového bujení.

Před zahájením léčby okrelizumabem je doporučováno stanovit koncentrace základních tříd imunoglobulinů a také specifických protilátek proti infekčním agens. Tyto protilátky jsou kontrolovány aktivní imunizací, a pokud jsou jejich hodnoty nedostatečné, je doporučeno očkovat. U nemocných již léčených okrelizumabem je kontraindikováno očkování živými vakcínami [15].

Při léčbě okrelizumabem nebyly u nemocných s RS zaznamenány případy rozvoje autoimunit, které běžně provázejí terapii alemtuzumabem, zahrnující rovněž B lymfocyty. To se jeví být mimořádnou výhodou okrelizumabu.

Léčba okrelizumabem není indikována u žen, které plánují těhotenství, a je kontraindikována u těhotných. Jde spíše o předběžnou opatrnost. Okrelizumab je protilátka třídy IgG₁, a je tedy teoreticky možný transplacentární přenos prostřednictvím receptoru FcRn (neonatal Fc receptor). Fyziologicky, s cílem ochrany novorozence, však dochází k přenosu mateřských protilátek třídy IgG₁ z matky na plod až na konci těhotenství, zhruba od 32. týdne. Z této obecné úvahy můžeme implikovat, že by případné těhotenství u ženy léčené okrelizumabem nemělo být problémem. Těhotenství je jednoduše zjistitelné krátce po početí. Při následném přerušení léčby okrelizumabem zbývá dost času, aby aplikovaný okrelizumab byl přirozeně eliminován [16].

Přibývají experimentální důkazy o tom, že molekula CD20 je vyjádřena také na malé frakci T lymfocytů periferní krve u nemocných s RS. Je dokládáno, že v porovnání se zdravými lidmi je u nemocných s RS podíl CD20+ T lymfocytů v periferní krvi a rovněž v mozkomíšním moku zvýšen. Sami jsme jejich přítomnost v periferní krvi nemocných s RS prokázali v malé pilotní studii. Na T lymfocytech je ve srovnání se subpopulací pomocných CD4+ T lymfocytů molekula CD20 ve vyšší míře vyjádřena v subpopulaci cytotoxických CD8+ T lymfocytů. Tyto T lymfocyty mají paměťový fenotyp a jejich počet v periferní krvi je snížen po léčbě okrelizumabem. Podrobnější analýzou bylo prokázáno, že CD8+/CD20+ T lymfocyty zahrnují elementy specificky rozpoznávající epitopy odvozené od MBP. CD8+/CD20+ T lymfocyty mají prokazatelně vyšší prozánětlivý potenciál a exprimují membránové molekuly zajišťující cílenou migraci do struktur CNS. Po aplikaci okrelizumabu jsou depletovány, ale jejich počet v periferní krvi je obnoven dříve, za přibližně 3–6 měsíců, ještě před obnovou B lymfocytů. Rychlá deplece této populace lymfocytů u nemocných s RS léčených okrelizumabem zřejmě významně přispívá k dobrému klinickému efektu této léčby [17].

Lze uzavřít, že vynikající účinnost okrelizumabu, doložená velkými studiemi a potvrzená též běžnou klinickou praxí, je dále umocněna bezpečností této léčby. Zásadní ovlivnění počtu B lymfocytů v periferní krvi, které je typické pro léčbu okrelizumabem, nemá negativní dopad na protektivní imunitu léčeného pacienta s RS. Vysvětlujeme si to především kompartmentalizací B lymfocytárního systému a faktem, že tato léčba neovlivňuje časná diferenciační stadia krvetvorby a nepůsobí negativně na plazmatické buňky, které jsou zdrojem protilátek. Je jisté, že vynikající klinický efekt léčby okrelizumabem je postaven na ovlivnění B lymfocytárního systému pacientů s RS prostřednictvím interakcí, které jsou přímo zapojeny do poškozujícího zánětu. Z nich zřejmě nejdůležitější budou interakce B lymfocytů s T lymfocytárním systémem. B lymfocyty slouží jako efektivní buňky prezentující antigen autoreaktivním T lymfocytům. Vytvářejí také podmínky pro jejich abnormální polarizaci do subsetů Th1 a Th17, jež představují podstatnou součást poškozujícího zánětu u nemocných s RS. Okrelizumab nepochybně snižuje i tvorbu autoprotilátek, které jsou na začátku několika mechanismů odpovědných za bezprostřední poškození struktur CNS, např. cestou aktivace komplementu, reakcí ADCC a rovněž zesílení fagocytárních funkcí [2].

Biologika okrelizumab, alemtuzumab a malá molekula kladribin, která zasahuje do purinového metabolismu buněk, především T a B lymfocytů, působí na poškozující zánět u nemocných s RS v porovnání s jinými léčivy komplexněji. Komplexnost jejich účinku je natolik unikátní, že je zvažována možnost zásadní proměny imunitního repertoáru T a B lymfocytů s možnými dlouhodobými pozitivními dopady na poškozující zánět u nemocných s RS. Na základě dlouhodobých komplexních účinků na poškozující zánět jsou alemtuzumab, kladribin a okrelizumab považovány za přípravky „rekonstituující“ imunitní systém. Výhodou je předpoklad, že by jejich podávání mohlo být jednorázové. Všechna ostatní léčiva musejí být nemocným s RS podávána kontinuálně. Imunitní rekonstituce je komunikována jako schopnost těchto léčiv významně zasáhnout do repertoáru T a B lymfocytů. Mají tak být odstraněny nebo alespoň potlačeny autoreaktivní T (B) lymfocyty a indukovány homeostaticky působící regulační mechanismy, např. Treg lymfocyty. S ohledem na komplexnost vzniku imunitního repertoáru T a B lymfocytů a jeho ovlivnění nespočetnými podněty, jimž je každý jedinec v průběhu života vystaven, budou zapotřebí další experimentální i klinické studie, jejichž výsledky buď potvrdí, nebo vyvrátí oprávněnost této koncepce [18].